固態發酵刺梨果渣改性膳食纖維工藝優化及結構特性分析

何蘭蘭，馬四補，姜 特，梁文娟，晉海軍，張麗艷

（貴州中醫藥大學，貴州貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）學名繅絲花，又稱送春歸，為薔薇科薔薇屬植物[1]，主要分布于我國貴州、云南，海拔500～2500 m 的向陽山坡、溝谷、灌木叢的熱帶及亞熱帶地區[2]。刺梨為貴州省的優勢資源，據2021 年報道，全省人工種植面積約156 萬畝，年產鮮果50 萬噸，產值達100 億元[3]。目前，刺梨相關產品的開發主要以刺梨汁為原料，榨汁后可產生大量果渣副產物，保守估計貴州省每年產刺梨果渣超過2 萬噸[4]。刺梨果渣易發霉、腐爛，不易保存，會造成環境污染。

刺梨果渣中含有較多的功能性成分，如膳食纖維（dietary fiber，DF）、維生素C 和黃酮類等，其中膳食纖維的含量高達70%以上[4]。膳食纖維是繼糖類、脂類、蛋白質、礦物質、維生素和水之后的“第七大營養物質”，據其溶解度不同，分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）。IDF 可減少排泄物在腸道的駐留時間，具有促進潤腸排便的功效[5]；SDF 具有降低血脂水平，降低血壓，改善血糖控制，減輕體重，改善免疫功能和減少炎癥等作用[6]。前人對刺梨果渣中膳食纖維提取工藝做過一些研究，但大多以SDF 為評價指標，而刺梨果渣中IDF 和SDF對人體均具有一定的有益功效，對植物材料中膳食纖維科學的評價指標應為SDF/IDF。郭京京等[7]和Zhang 等[8]均以SDF/IDF 為評價指標，分別對沙棘渣、銀耳中膳食纖維做出科學評價。本課題組前期研究發現刺梨果渣中SDF 含量較低，不利于其果渣資源的二次開發利用[3]。營養學家認為，提高SDF 在DF 中的比例，可增強膳食纖維的功效[9]。根據膳食纖維的功能和結構特點，采用化學法、酶解法、化學-酶結合法、微生物發酵法等方法可提高SDF 含量。其中微生物發酵法具有反應條件溫和、污染少、易處理等優點，其又可分為液態發酵與固態發酵，發酵刺梨果渣大多采用微生物液態發酵法，未見固態發酵[2]。微生物固態發酵相較于液態發酵具有水分活度低、易生長、酶活力高、發酵過程無需嚴格無菌、成本低、易操作、可產生特殊風味、提高營養價值等優點[10]。

本文以SDF/IDF 為響應值，篩選刺梨果渣微生物固態發酵發酵優勢菌種，采用響應面法對發酵工藝進行優化，以期獲得最佳發酵工藝；通過持水性、持油性及膨脹力，分析發酵前后DF 理化性質的改變；利用掃描電鏡、傅里葉紅外光譜及X-射線分析發酵前后DF 結構變化。本文旨在提高刺梨果渣SDF/IDF，改善DF 理化性質及結構特性，為今后開發刺梨果渣副產品，提高其資源的利用率，減少資源浪費提供技術資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮刺梨果渣 國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司提供；發酵菌種（枯草芽孢桿菌、綠色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、平菇、靈芝）中國工業微生物菌種保藏管理中心；耐高溫α-淀粉酶（酶活力≥4×104U/g）、糖苷酶（酶活力≥1.0×105U/g）北京索萊寶科技有限公司；酸洗硅藻土上海麥克林生化科技股份有限公司；其它試劑均為國產分析純。

XS205 型電子天平 瑞士梅特勒公司；L-600 型離心機 湘儀離心機有限公司；UV2510PC 型紫外分光光度 島津企業管理（中國）有限公司；D8 Advance 粉末X 射線衍射儀 布魯克（北京）科技有限公司；Nicolet iS50 FT-IR 傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Fisher 公司；日本高分辨冷場發射掃描電鏡日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 刺梨果渣固態發酵菌種篩選

1.2.1.1 培養基的配制 MRS 培養基、PDA 培養基、麥芽汁瓊脂培養基、乳酸菌培養基、查氏瓊脂培養基等均按照菌種說明書配制。

1.2.1.2 菌種的活化及擴大培養 將從中國工業菌種保藏管理中心購買的菌株枯草芽孢桿菌、綠色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、平菇、靈芝按照相關說明進行活化處理，然后將活化的菌種轉接至2～3 代恢復活力。

1.2.1.3 種子液的制備 將恢復活力后的菌株接種于液體搖瓶培養基中，按菌種說明書條件下培養，使其產生大量菌體，作為種子液。

1.2.1.4 刺梨果渣固態發酵菌種篩選 新鮮刺梨果渣：刺梨經國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司榨汁后得到的廢棄物。

以新鮮刺梨果渣為培養基，選取食品發酵常用菌種枯草芽孢桿菌、綠色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、平菇、靈芝分別進行單菌發酵，對比發酵后SDF/IDF，選取最優發酵菌種。

1.2.1.5 膳食纖維得率測定 參照鄭佳欣[11]的酶-重量法，根據公式（1）～（4）測定膳食纖維（DF）、不溶性膳食纖維（IDF）、可溶性膳食纖維（SDF）得率。取干燥至恒重刺梨果渣1 g（m0），加入0.05 mol/L MESTRIS 緩沖液，磁力攪拌器使混合均勻。先后加入熱穩定α-淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡萄糖苷酶酶解，過濾，將沉淀先后經70 ℃熱水、78 %乙醇、95 %乙醇和丙酮洗滌2 次，烘干，即得m1（IDF）；上清液，加入4 倍體積95 %乙醇溶液（提前預熱至60 ℃），室溫下靜置12 h，離心，收集沉淀，烘干，即得m2（SDF）。

1.2.2 刺梨果渣固態發酵工藝優化

1.2.2.1 單因素實驗 接菌量對SDF/IDF 的影響：每個發酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121℃滅菌30 min，發酵溫度40 ℃，發酵時間4 d，考察發酵菌種接種量3%，6%，9%，12%，15%對SDF/IDF 的影響。

發酵溫度對SDF/IDF 的影響：每個發酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121 ℃滅菌30 min，發酵接菌量6%，發酵時間4 d，分別考察發酵溫度25、30、35、40、45 ℃對SDF/IDF 的影響。

發酵時間對SDF/IDF 的影響：每個發酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121 ℃滅菌30 min，發酵接菌量6%，發酵溫度40 ℃，分別考察發酵時間2、3、4、5、6 d 對SDF/IDF 的影響。

1.2.2.2 響應面試驗優化發酵工藝 在單因素實驗基礎上，利用軟件Design-Expert 8.0.6 進行Box-Behnken 試驗，設計三因素三水平試驗，以發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接菌量（C）為自變量，SDF/IDF 為響應值，優化發酵工藝，設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平Table 1 Factor levels of Box-Behnken experimental

1.2.3 膳食纖維理化性質分析

1.2.3.1 持水力的測定 取0.2 g 干燥DF，于15 mL離心管中，稱其質量為m0，加入10 mL 蒸餾水，振蕩搖勻，靜置24 h，8000 r/min 離心10 min，棄掉上清液，稱其質量為m1，根據下式計算持水力[12]：

1.2.3.2 膨脹力的測定 取0.25 g 干燥DF，于15 mL 試管中，記錄體積為V0，加入10 mL 蒸餾水，振蕩搖勻，靜置24 h，記錄其膨脹后體積V1，根據下式計算膨脹力[12]：

1.2.3.3 持油力的測定 取0.2 g 干燥DF，于離心管中，加入適量植物油，靜置24 h，過濾，稱濕質量（m1），根據下式計算持油力[12]：

1.2.4 膳食纖維的結構表征

1.2.4.1 電鏡檢測（SEM）將發酵前和發酵后的DF 干燥至質量恒定，取適量DF 于掃描電鏡下觀察其超微結構[9]。

1.2.4.2 傅里葉紅外光譜分析（FT-IR）取適量DF 于研缽中，加入溴化鉀，充分研磨，裝入模具，制成薄片，放入儀器，分析掃描，掃描次數：32 次，分辨率：4 cm-1，掃描范圍：500～4000 cm-1[13]。

1.2.4.3 X-射線衍射分析（XRD）取適量DF 于樣品槽，用玻璃板壓實樣品，使表面平整，將載樣板插入儀器測試底座，測試條件：加載電壓40 kV，步寬0.02°，掃描速率4°/min，掃描角度10°～45°[14]。

1.3 數據處理

所有實驗數據均平行測定3 次，采用SPSS 26.0 進行單因素方差分析，P＜0.05 表示具有統計學意義、Design Expert 8.0.6、Jade 進行數據處理與分析，采用Origin 2021 b 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 固態發酵菌種對刺梨果渣SDF/IDF 的影響

由圖1 可知，除黑曲霉外，其余菌種發酵刺梨果渣后均可使SDF/IDF 的比值升高，其中經枯草芽孢桿菌、米曲霉發酵后，SDF/IDF 顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），說明枯草芽孢桿菌、米曲霉對刺梨果渣膳食纖維有較好的改性作用，且枯草芽孢桿菌的作用效果最顯著，因此本研究選取枯草芽孢桿菌為固態發酵菌種。枯草芽孢桿菌具有生長溫度范圍寬、發酵時間短、菌體自身可合成纖維素酶等優勢。張智等[15]采用甘蔗渣制備膳食纖維時，也以枯草芽孢桿菌為發酵菌種，提高了可溶性膳食纖維的得率，同時改善了膳食纖維的結構及理化性質。

圖1 不同菌種對刺梨果渣SDF/IDF 的影響Fig.1 Effect of different bacterial strains on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 接菌量對SDF/IDF 的影響 由圖2 可知，SDF/IDF 隨著接種量的增加呈先上升后下降趨勢，下降后趨于平緩。當接菌量為6%時，SDF/IDF 達到最高為14.71%。當接菌量低于6%時，可能由于菌種量較少導致發酵不徹底，不能將植物細胞壁的致密結構完全破壞，使得SDF 的積累量較少；當接菌量高于6%時，SDF/IDF 呈下降趨勢，可能是因為接種量過大，使得菌種生長繁殖旺盛，導致底物營養物質供應不足，開始逐漸消耗積累的SDF，造成SDF/IDF 下降[16-17]。

圖2 接菌量對刺梨果渣SDF/IDF 的影響Fig.2 Effect of bacterial inoculation on SDF/IDFof Rosa roxburghii pomace

2.2.2 發酵溫度對SDF/IDF 的影響 由圖3 可知，隨發酵溫度的增加SDF/IDF 呈先上升后下降趨勢。發酵溫度為40 °C時，SDF/IDF 達14.58%。當發酵溫度低于40 °C時，可能是因為環境溫度達不到菌種適宜生長溫度，生長代謝較慢，產生纖維素酶較少，導致SDF 積累量少，使得SDF/IDF 降低；當發酵溫度超過40 ℃時，可能培養基中水分揮發較快，水分減少，影響菌種的生長，或者由于超過菌種適宜的生長溫度，在一定程度上抑制菌種的生長以及纖維素酶的活性[18]，使得SDF/IDF 降低，故最佳發酵溫度為40 ℃。

圖3 溫度對刺梨果渣SDF/IDF 的影響Fig.3 Effect of temperature on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

2.2.3 發酵時間對SDF/IDF 的影響 由圖4 可知，隨著發酵時間的延長，SDF/IDF 先上升后下降。發

圖4 發酵時間對刺梨果渣SDF/IDF 的影響Fig.4 Effect of fermentation time on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

酵時間為4 d 時SDF/IDF 達14.92%。當發酵時間小于4 d 時，可能是因為發酵時間過短，菌種數量較少，發酵不完全，也可能是因為發酵時間過短不利于纖維素酶的合成；當發酵時間高于4 d 時，可能是因為生成了一些不利于菌體生長的物質，致使菌種活性降低，產生酶減少，也可能是生長到一定階段后，基質被消耗，培養基中的養分不足以維持其生長，生成的SDF 被分解成糖類[19]，進而使其SDF/IDF 降低，故最佳發酵時間選擇為4 d。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果 在單因素實驗的基礎上，運用Box-Behnken 試驗設計原理，以接種量、發酵溫度、發酵時間為自變量，以SDF/IDF 為響應值，進行三因素三水平試驗，結果見表2。以Design Expert 8.0.6 對數據進行分析，得到A、B、C 與Y 二次回歸方程：Y=14.32+0.005A+0.46B+0.33C-0.31AB+0.66AC-0.81BC-1.25A2-1.37B2-0.41C2。由 表3 可知，P=0.0033＜0.01，說明模型極顯著。失擬項P=0.0767＞0.05，失擬項不顯著，表明該模型擬合度較好。模型的決定系數R2=0.9261，調整決定系數R2adj=0.8310，表明該模型試驗值與預測值間相關性較高，有83.10%實際數據能用于模型解釋；F值越大，反映因素對響應值的影響越大，由此可知各因素對刺梨果渣中SDF 與IDF 的比值影響大小次序為發酵溫度（B）＞接種量（C）＞時間（A）；一次項B 差異顯著（P=0.0411＜0.05），A（P=0.9791）和C（P=0.1181）差異不顯著（P＞0.05）；交互項AB（P=0.2773＞0.05）差異不顯著、AC（P=0.0399）、BC（P=0.0172）均差異顯著（P＜0.05）；二次項A2（P=0.0017）和B2（P=0.001）差異極顯著（P＜0.01），C2（P=0.1481＞0.05）差異不顯著。

表2 Box-Behnken 試驗與響應值結果Table 2 Results of Box-Behnken test and response values

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.3.2 響應曲面分析 表3 顯示，FAB＜FAC＜FBC，根據F值可知發酵時間與溫度的交互作用對刺梨果渣SDF/IDF 的干擾最小，而接菌量與溫度的交互作用對刺梨果渣SDF/IDF 的干擾最大。在響應面圖中，等高線的形狀為圓形時表示各因素之間的交互作用不顯著，若為橢圓形則表示交互作用顯著[20]。圖5是各因素之間交互作用的三維響應面圖和等高線圖，AB 等高線形狀為圓形，應曲面坡度不大，說明兩因素間交互作用對刺梨果渣中SDF/IDF 的影響顯著性不大；從AC 等高線圖得知，等高線為橢圓形，表明兩者的交互作用顯著，沿發酵時間軸向等高線的變化密集，沿接菌量軸向等高線的變化稀疏，說明時間比接菌量更能影響刺梨果渣SDF/IDF；BC 等高線圖近似橢圓形表明兩者的交互作用顯著，從等高線圖得知，沿接菌量軸向等高線的變化密集，沿發酵溫度軸向等高線的變化稀疏，說明接菌量比發酵溫度更能影響SDF/IDF。

圖5 各因素交互作用對刺梨果渣 SDF/IDF 影響的響應面圖Fig.5 Response surface graph of the interaction of various factors on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

2.4 最佳提取條件的預測和驗證

經Design-Expert 8.0.6 軟件分析，最佳發酵工藝為：發酵時間4.13 d，發酵溫度40.03 ℃，接菌量7.48%。從實際操作角度考慮，對最佳發酵條件調整為：發酵時間4 d，發酵溫度40 ℃，接菌量7.5%。驗證試驗測得刺梨果渣SDF/IDF 為14.21%±0.42%；說明此響應面法優化得到的刺梨果渣發酵工藝準確可靠。

2.5 刺梨果渣發酵前后膳食纖維理化性質分析

由表4 可知，發酵后刺梨果渣的膳食纖維持水力、持油力及膨脹力均高于未發酵組，表明發酵后刺梨果渣膳食纖維的理化性質發生了改變，在持水、持油及膨脹性方面都有所提升。此結果與Wang 等[13]的報道相似，這可能與膳食纖維結構改善有關，發酵后膳食纖維結構變得疏松，比表面積增大，使得纖維素與半纖維素中暴露出更多的親水基團，產生SDF比例增多，持水性增強，同時改善其膨脹性[21-22]。

表4 發酵前后刺梨果渣DF 理化分析Table 4 DF physicochemical analysis of Rosa roxburghii pomace before and after fermentation

2.6 刺梨果渣發酵前后膳食纖維結構表征

2.6.1 掃描電子顯微鏡分析 如圖6 所示，在相同倍率下對比刺梨果渣發酵前后顯微圖，UF-DF 表面光滑，有少量褶皺，呈現致密、規則結構；F-DF 表面出現裂紋，比表面積增大，有顆粒物附著且結構較疏松，呈片狀可能是由于發酵產生了纖維素酶并對纖維素進行了降解，改善了微觀結構，疏松的結構有利于膳食纖維樣品的水化和提高其吸附性能，因此，推測FDF 結構的改變，是導致其持水力、持油力和膨脹力增加的主要原因[23-26]。

圖6 刺梨果渣膳食纖維掃描電子顯微鏡圖Fig.6 Scanning electron microscopy images of dietary fiber from Rosa roxburghii pomace

2.6.2 傅立葉紅外光譜分析 由圖7 可知，發酵前后DF 在吸收峰上沒有明顯變化，僅在吸收強度上存在微小差異，3423 cm-1處出現的吸收峰，可能是由于半纖維素和纖維素-OH 基團的振動引起，氫鍵在分子間形成，F-DF 在此處吸收強度比UF-DF 強，說明經過發酵處理DF 糖苷鍵斷裂，合成氫鍵的羥基增多，導致內部締合的氫鍵較多[6]。2922 cm-1出現較弱吸收峰，表明-CH 和-CH2基團存在，是纖維素的典型結構[27]。1739 cm-1處出現的峰可能是醛或酯中C=O 的特征峰，半纖維素的乙酰基和糖醛酸酯基的伸展。1603 cm-1處出現的峰可能是羰基吸收峰，由C=O 鍵伸縮振動引起，表明其中可能存在糖醛酸[28]。1246～1427 cm-1處的峰與C-H 的變角振動有關，說明樣品中可能含有木質素，發酵后DF 吸收強度減小，這表明可能發酵后DF 中木質素含量減少[29]。1035 cm-1的峰是C-O 的伸縮振動，通常報道為阿拉伯糖和木聚糖[13]。綜上，F-DF 的紅外譜圖相較于UF-DF 都有特征吸收峰，僅有部分波長對應吸收強度的差異，表明官能團基本相似，并未產生新的官能團，它們的親水性基團和其他活性基團在發酵過程中沒有發生變化。

圖7 發酵前（UF-DF）和發酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纖維傅里葉紅外光譜圖Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) ofRosa roxburghii pomace

2.6.3 X 射線衍射分析 纖維素晶體結構分為纖維素I-V 5 種結晶構型[30]。圖8 為刺梨果渣 DF 發酵前后的XRD 圖，可以看出2θ在15.34°和22.09°時有明顯的結晶衍射峰，且在34.65°處有一個較弱的衍射峰，是纖維素I 的典型晶體構型[31]，發酵前后膳食纖維衍射峰的位置沒有改變，只有衍射強度差異，這表明發酵并未使膳食纖維的結晶構型發生顯著性改變。經Jade 7.0 軟件擬合后發現，F-DF 相對結晶度為28.25%，UF-DF 相對結晶度為36.83%，相對結晶度降低了8.58%，說明發酵處理使纖維素和半纖維素發生降解，破壞了晶體結構，導致結晶度減小[32]；聚合力降低，使這些結構組分溶出或轉化為水溶性成分溶出，導致刺梨果渣DF 的功能特性的變化[16]。

圖8 發酵前（UF-DF）和發酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纖維X-射線衍射光譜Fig.8 X-ray diffraction spectra of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) ofRosa roxburghii pomace

3 結論

本研究以刺梨果渣為原料，以枯草芽孢桿菌為菌種進行固態發酵改性膳食纖維，設計單因素實驗與響應面法優化發酵工藝，研究發酵時間、溫度及接菌量對SDF 與IDF 的比值影響，得出刺梨果渣最佳發酵工藝為：發酵時間4 d，發酵溫度40 ℃，接菌量為7.5%，該條件下SDF 與IDF 的比值為14.21%±0.42%；分析發酵前后膳食纖維理化性質，發現刺梨果渣發酵后膳食纖維持水力、持油力及膨脹力有所提高；對發酵前后膳食纖維進行掃描電鏡、紅外光譜及X-射線衍射分析，電子掃描電鏡結果顯示，發酵后DF 結構疏松，表面有顆粒附著，比表面積增大，呈片狀，表明發酵處理使刺梨果渣膳食纖維結構發生改變；在發酵前后FT-IR 譜圖中沒有出現新的峰，也沒有出現明顯峰的位置與數目變化，這表明并未產生新的化學基團，譜圖中只存在強度的微小差異，說明是分子內基團數目有所變化，其中1427 cm-1處吸收強度減弱，因此，推測發酵使得刺梨果渣中木質素減少；XRD 測定發現，發酵并未改變刺梨果渣I 型纖維素的晶體特征，但相比發酵前相對結晶度減弱，這可能是原料中纖維素發生降解，纖維的結晶區和非結晶區被破壞所導致。因此，刺梨果渣經枯草芽孢桿菌固態發酵后，可使SDF/IDF 升高，且改善了膳食纖維的理化性質及結構特性。

發酵后刺梨果渣膳食纖維持水力、持油力、膨脹力增強，飽腹感增加；結構疏松，入口更加柔軟，促進腸道蠕動，使其成為優質膳食纖維的制備原料，可提高刺梨果渣的利用率，為刺梨果渣的有效利用提供了依據，減少了資源浪費。本研究用單一菌種枯草芽孢桿菌發酵刺梨果渣來改性膳食纖維，但并未研究多菌種混合發酵，有待進一步研究混合菌種發酵對SDF/IDF 的影響；除研究刺梨果渣發酵后膳食纖維變化情況外，今后還應對維生素C、黃酮、SOD 等成分的變化進行分析，以期對發酵后的刺梨果渣資源進行科學評價。