小果薔薇不同采收時期葉和莖中主要活性成分的變化

周瑤瑤，張曉元 ，陳 雄，羅韶剛，曾令杰

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州 510006；2.韶關市華工高新技術產業研究院，廣東韶關 512027；3.華南理工大學工業技術研究總院，廣東廣州 510640）

小果薔薇為薔薇科薔薇屬（Rosa cymosaTratt.）的植物，別名小金櫻、金櫻根、倒鉤簕、紅荊藤、山木香等[1]。在我國廣泛分布，其資源非常豐富[2]。小果薔薇具有很高的藥用價值，可用于治療創傷、止瀉、萎縮性胃炎、子宮脫垂等[3-7]，同時，小果薔薇也具有一定食用價值，被開發用于健脾開胃的甜酒曲、米酒酒曲等[8]，其果實被廣泛用于保健品的天然植物果實，其富含維生素、還原糖、粗蛋白和幾種礦質元素，具有很高的營養價值[9]，可熬糖、制汁等[10]，在一些藏民族等地區常被使用制作成果醬。

通常，植物因受到外界環境等因素的影響，體內會產生和積累一些具有生物活性的次生代謝產物，而這些產物會表現出一定的變化[11]。已有研究發現，藥用植物體內產生的二次代謝產物隨著生長年限的增長，其含量會出現一定程度的波動[12-14]。從小果薔薇分離得到的最多的化合物為三萜類有機酸，其次是糖苷類化合物[15-19]。目前，在實際生產過程中，每年對小果薔薇采收至少在3 次以上，但對于小果薔薇的采收時期及采收部位，各地區都不一樣，沒有統一標準。因此，不同的采收時期會影響小果薔薇葉和莖活性成分的種類和含量，進而影響其質量。為了更好地開發、利用小果薔薇資源，有必要了解生長過程中所含成分的變化規律，為此，本研究對不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖、總有機酸和鞣花酸的含量進行了動態觀察與分析，旨在為小果薔薇最佳采收期的確定提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小果薔薇樣品 采自廣東省韶關市武江區龍歸鎮野生環境，經華南理工大學張曉元教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物（Rosa cymosaTratt.），其采收時間為2021 年2 月25 日～12 月25 日，每月采樣1 次，每次采樣2 批，每批樣品2 kg（以鮮品計），采收后莖和葉一起陰干，陰干后分離莖和葉，粉碎，過三號篩，樣品信息見表1；鞣花酸 壇墨質檢科技股份有限公司；熊果酸 成都曼斯特生物科技有限公司；無水葡萄糖、苯酚 天津市大茂化學試劑廠；無水乙醇 湖南匯虹試劑有限公司；甲醇 西隴科學股份有限公司；香草醛 上海展云化工有限公司；高氯酸 廣州化學試劑有限公司；冰醋酸 西隴科學股份有限公司；硫酸 西隴科學股份有限公司；娃哈哈純水 市售。LC-16 型高效液相色譜儀 島津儀器蘇州有限公司；UV-9000S 型紫外可見分光光度計 上海元析有限公司；SPD-M20A 型二極管陣列檢測器 島津儀器蘇州有限公司，BSA224S 型分析天平 賽多利斯；GL-20M 型高速冷凍離心機 長沙易達儀器有限公司；HHS-11-4 型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司；SB25-12DTD 型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；YB-4500A 型多功能粉碎機永康速峰工貿有限公司。

表1 小果薔薇樣品信息Table 1 Sample information of Rosa cymosa Tratt.

1.2 實驗方法

1.2.1 總多糖含量的測定 參照管美玉等[20]方法，取樣品粉末（過三號篩）1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷后至250 mL 的量瓶中，用少量水洗滌4 次，洗液合并，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取10 mL，加無水乙醇25 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（4000 r/min）20 min，棄去上清液（必要時濾過），沉淀加熱水溶解，轉移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得，備用。

精密量取樣液1 mL，分別加5%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻，于100 ℃水浴中加熱20 min，置冰水浴中5 min，取出，在488 nm 波長處測定吸光度，結果以葡萄糖（mg·g-1）表示。

1.2.2 總有機酸含量的測定 參照邵峰等[21]方法。稱取樣品粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，搖勻，超聲（40 kW，500 Hz）1 h，離心（6000 r/min）15 min，取上清液作為供試品溶液備用。

精密量取0.1 mL 供試品溶液于10 mL 試管中，置于100 ℃的水浴中，分別加5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，混勻，迅速加入高氯酸1.0 mL，搖勻，于60 ℃水浴中，取出，置冰水浴中5 min，加入5.0 mL 冰醋酸，混勻，室溫放置10 min，取出，在波長550 nm 處測定吸光度，結果以熊果酸（mg·g-1）表示。

1.2.3 鞣花酸含量的測定

1.2.3.1 樣品制備 稱取樣品1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取75%甲醇50 mL，搖勻，超聲處理（40 kW，500 Hz）30 min，混勻，離心（6000 r/min）15 min，精密量取上清液0.5 mL，加75%甲醇定容至1 mL 容量瓶中，混勻，作為供試品溶液備用。

色譜柱選擇：色譜柱：SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

洗脫程序：流動相為以乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動相；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量為10 μL；檢測波長為254 nm。

1.2.3.2 線性關系考察 精密量取鞣花酸對照品溶液，用甲醇溶解配制成質量濃度分別為50、20、10、5、1 μg/mL 的標準曲線溶液，按照色譜條件“1.2.3.1”項下依次進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品質量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.3 精密度試驗 取對照品溶液，按“1.2.3.1”項下色譜條件連續測定6 次，記錄鞣花酸成分的峰面積，計算RSD。

1.2.3.4 重復性試驗 取同一批采收時期的小果薔薇葉和莖樣品6 份，按“1.2.3.1”項下方法制備6 份供試品溶液，按“1.2.3.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算小果薔薇葉和莖中鞣花酸含量的RSD。

1.2.3.5 穩定性試驗 取同一采收時期的小果薔薇葉和莖樣品，按“1.2.3.1”項下方法制備供試品供試品溶液，分別于0、2、8、12、24、36 h 按“1.2.3.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算小果薔薇葉和莖中鞣花酸峰面積的RSD。

1.2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的小果薔薇葉和小果薔薇莖，分別加入一定量的鞣花酸對照品溶液，按“1.2.3.1”項下制成供試品溶液，在“1.2.3.1”項下色譜條件進行進樣測定，計算加樣回收率和RSD。

1.3 數據處理

所有數據平行測定三次，結果以 X±S（平均值±標準偏差）表示。利用SPSS Statisctics 26.0 軟件對數據進行方差分析，P＜0.05 表示差異顯著；利用Origin 2021 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

2.1.1 線性關系、精密度、重復性、穩定性和加樣回收率考察 鞣花酸含量測定得到的回歸方程分別為：Y=93370X-89010.7，r=0.999774。結果表明鞣花酸在1～100 μg/mL 范圍內線性關系良好。

鞣花酸的精密度RSD 為0.21%。葉和莖的重復性和穩定性RSD 值分別為：2.78%和1.44%；1.65%和2.15%。表明儀器精密度良好、方法重復性良好且樣品分別在36 h 內穩定。

由表2 結果顯示，鞣花酸加樣回收率的RSD 分別為1.08%、0.94%、0.91%（葉）；0.74%、0.92%、1.86%（莖），表明回收率較好。

表2 加樣回收率試驗結果Table 2 Results of sample recovery rate test

2.2 不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖、總有機酸和鞣花酸含量的動態變化

2.2.1 不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖含量的動態變化 由表3～表4 測定結果可知，不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖含量差異性顯著（P＜0.05）。不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖含量范圍分別為9.563～23.164 mg·g-1和0.763～15.650 mg·g-1。不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖含量整體上呈現波動式變化，葉在2 月到8 月采收的含量呈現逐漸上升趨勢，在8 月采收的含量較高，為23.164 mg·g-1，8 月到11 月逐漸下降，隨后在11 月到12 月回升，且在11 月采收的含量較低，為9.563 mg·g-1。莖在2 月到7 月采收的含量逐漸下降，其中在2 月采收的含量較高，為15.650 mg·g-1，而在7 月采收的含量較低，為0.763 mg·g-1，7 月到8 月采收的含量快速回升，最后在8 月到12 月采收的含量逐漸下降。研究結果分析得出，小果薔薇葉和莖中總多糖含量分別在8 月和2 月達到了最高點，由此推測小果薔薇葉和莖中總多糖可能與生長溫度有關，夏季雨熱同期且時間長，小果薔薇植株生長較快，需要消耗大量的能量，根莖部總多糖含量往葉轉移。經秋季結果期后，受到冬季低溫霜凍等氣候的影響，植物生理功能下降，小果薔薇葉枯萎，有效成分往莖轉移，導致部分活性成分含量達到峰值。這與陸廷祥等[22]研究土黨參中總多糖活性成分的含量受采收期影響的結果一致。

表3 不同采收時期小果薔薇葉中總多糖、總有機酸和鞣花酸含量測定結果（，n=3）Table 3 Results of total polysaccharide,total organic acid and ellagic acid content in leaf of Rosa cymosa Tratt.at different harvest periods (,n=3)

表3 不同采收時期小果薔薇葉中總多糖、總有機酸和鞣花酸含量測定結果（，n=3）Table 3 Results of total polysaccharide,total organic acid and ellagic acid content in leaf of Rosa cymosa Tratt.at different harvest periods (,n=3)

注：同列標有不同小寫字母者表示組間差異顯著（P＜0.05）；表4同。

表4 不同采收時期小果薔薇莖中鞣花酸、總有機酸和總多糖含量測定結果（，n=3）Table 4 Results of total polysaccharide,total organic acid and ellagic acid content in stem of Rosa cymosa Tratt.at different harvest periods (,n=3)

表4 不同采收時期小果薔薇莖中鞣花酸、總有機酸和總多糖含量測定結果（，n=3）Table 4 Results of total polysaccharide,total organic acid and ellagic acid content in stem of Rosa cymosa Tratt.at different harvest periods (,n=3)

2.2.2 不同采收時期小果薔薇葉和莖中總有機酸含量的動態變化 由表3～表4 測定結果可知，不同采收時期小果薔薇葉中總有機酸含量差異性顯著（P＜0.05）。不同采收時期小果薔薇葉和莖中總有機酸含量分別在64.847～111.484 mg·g-1和22.241～178.960 mg·g-1。不同采收時期小果薔薇葉中總有機酸含量整體上呈現波動式變化，其中在2 月到3 月采收的含量快速下降，3 月到6 月采收的含量呈波動式上升，6 月到12 月采收的含量呈波動式下降；在2 月、6 月和8 月采收的含量較高，分別為111.484、111.342 和102.425 mg·g-1，而在3 月采收的含量較低，為64.847 mg·g-1。莖在2 月到5 月采收的含量呈現波動式上升，5 月到7 月采收的含量快速下降，7 月到9 月采收的含量逐漸上升，最后在9 月到12 月采收的含量波動式下降。其中在9 月到5 月采收的含量較高，分別為178.960 和171.123 mg·g-1，而在12 月采收的含量較低，為22.241 mg·g-1。

植物體內三萜類組成和含量隨著植物的遺傳背景、組織類型、生長年齡、生理狀況及環境 因子的變化而發生變化[23-24]。結果表明，隨著季節的升溫，小果薔薇植株的生長，葉和莖都進入快速生長時期，次生代謝產物含量明顯升高，這與高偉城等[25]研究枇杷葉中總三萜酸在5 月采收含量最高基本一致；與王玉霞等[26]研究夏枯草最佳采收期相近。總有機酸在小果薔薇不同部位及相同部位不同采收期的含量變化提示，其生物合成與植物生長發育不同階段有關。

2.2.3 不同采收時期小果薔薇葉和莖中鞣花酸含量的動態變化 由表3～表4 測定結果可知，不同采收時期小果薔薇葉和莖中鞣花酸含量差異性顯著（P＜0.05）。不同采收時期小果薔薇葉和莖中鞣花酸含量范圍分別 在0.039～0.077 mg·g-1和0.013～0.038 mg·g-1。不同采收時期小果薔薇葉和莖中鞣花酸含量在總體波動趨勢下呈現下降趨勢。其中葉在2 月到8 月采收的含量呈波動式上升趨勢，在4 月、6 月和8 月采收的含量較高，分別為0.074、0.077 和0.074 mg·g-1，此后8 月到12 月呈下降趨勢，到10 月和12 月采收的含量較低分別為0.041和0.039 mg·g-1。莖中鞣花酸含量從2 月和6 月采收呈波動式變化，在2 月和4 月采收的含量較高，分別為0.037 和0.038 mg·g-1，此后呈下降趨勢，在10 月采收的含量較低，為0.013 mg·g-1。通過對比研究發現，小果薔薇葉中鞣花酸含量高于小果薔薇莖。

酚類物質在果實生長發育前期含量較高，主要是前期酚類物質合成速率較快；隨著果實早期的快速生長發育，酚類物質合成與含量逐漸被“稀釋”[27]，因而從結果分析可以看出，鞣花酸含量在開花期4 月左右含量逐漸上升，在始果期8、9 月含量達到最大值，而在果實成熟期后呈降低趨勢。這與黃仕清等[28]研究地稔最佳采收期為5～9 月相近，和王燕[29]研究大花紫薇葉中鞣花酸含量在始果期8 月下旬達到最高結果基本一致，與尹海波等[30]研究牻牛在六月末鞣花酸含量達到最大值一致。因此，據此含量變化規律，可確定小果薔薇葉在4、6、8 月為適宜采收期，此時有效成分鞣花酸的含量較高。

2.3 聚類分析

運用SPSS26.0 軟件對不同采收時期小果薔薇葉和莖樣品3 個成分的含量測定結果進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以皮爾遜相關系距離為測度樣得圖1～圖2。結果顯示聚類明顯，葉中，當類間距離為5 時，聚為3 類，一類為4、6、3、8、11、2，一類為7、10、12，另一類為5、9。莖中，當類間距離為15 時，聚為3 類，一類為2、11、6、10，一類為7、8、12，另一類為4、5、3、9。

圖1 小果薔薇葉聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of Rosa cymosa Tratt.in leaf

圖2 小果薔薇莖聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of Rosa cymosa Tratt.in stem

2.4 主成分分析

以3 個成分含量測定結果為變量，采用SPSS 26.0 軟件進行主成分分析，選取特征值大于0.7，其中葉和莖累計貢獻率分別達到77.067%和82.970%的前2 個主成分，表明這2 個成分能夠很好地代表小果薔薇葉和莖主要特征及基本信息。根據各成分得分系數矩陣，分別按公式（1）、公式（4）計算主成分1 的因子得分（F1）、按公式（2）、公式（5）計算主成分2 的因子得分（F2），用各成分的方差貢獻率為權重，以2 個主成分對小果薔薇葉和莖進行綜合評價并對結果進行排序，按公式（3）、公式（6）計算其綜合評價F。

其中，F1、F2 中X1～X3參與計算的系數來源于表5 對應的數值。F 中參與計算的系數為表6中主成分1 和2 的方差貢獻率。

表5 各因子初始因子載荷矩陣Table 5 Initial factor load matrix of each factor

表6 特征根、各主成分的貢獻率Table 6 Contribution rate of characteristic roots and principal components

由評價模型計算出小果薔薇葉和莖各主成分得分、綜合得分、排名情況，由表7～表8 可知，不同采收小果薔薇葉綜合得分由高到低依次為8 月、6 月、7 月、2 月、9 月、4 月和5 月、12 月、3 月、10 月；莖為2 月、4 月、5 月和9 月、6 月、8 月、7 月、11 月、3 月、10 月、12 月。

表7 不同采收時期小果薔薇葉主成分評分和綜合評分Table 7 Principal component score in leaf of Rosa cymosa Tratt.at different harvest periods

表8 不同采收時期小果薔薇莖主成分評分和綜合評分Table 8 Principal component score in stem of Rosa cymosa Tratt.at different harvest periods

由圖3～圖4 可以看出，根據 PC1、PC2 的得分情況，大致可以分三個部分：葉中，采收時期6 月、7 月、8 月均在PC1 和PC2 的正向區間(第一象限和第二象限），說明這三個時期采收的總多糖、總有機酸和鞣花酸含量較高，因此6 月、7 月、8 月采收品質較優，排名靠前；莖中，采收時期2 月、4 月和6 月均位于 PC1 和PC2 的正向區間（第一象限），說明這三個時期采收的總多糖、總有機酸和鞣花酸含量較高，因此，排名也相對靠前。

圖3 小果薔薇葉主成分得分圖Fig.3 PCA scores of Rosa cymosa Tratt.in leaf

圖4 小果薔薇莖主成分得分圖Fig.4 PCA scores of Rosa cymosa Tratt.in stem

3 結論

目前，文獻對中藥材采收及藥效成分的動態積累研究中，通常只以日期或日歷上節令為考察的時間節點，對于地域分布廣泛的藥用植物，難以獲得普適性規律。本論文對不同采收時期小果薔薇葉和莖中總多糖、總有機酸和鞣花酸的含量進行了測定，并進行了方差分析、聚類分析和主成分分析，結果顯示，小果薔薇葉的適宜采收時期為8 月，莖的適宜采收時期為2 月。本論文的研究結果可為小果薔薇的采收提供參考。

因所有小果薔薇樣品均在野外采收，其采收條件具有一定的困難，因此后續可以采集小果薔薇樣品進行扦插栽培研究，并將野外采集的樣品和栽培樣品進行對比，以進一步開發和利用小果薔薇資源。除了采收時期外，其他許多因素均可影響小果薔薇的質量，需待進一步研究。