利用mPCR 方法檢測巴氏奶中致病菌的魯棒性研究

劉芝榮，張英華

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

由于巴氏奶殺菌條件溫和，能夠最大限度地保留原料奶中的營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味，深受消費(fèi)者歡迎[1-2]。然而，有研究表明近50%的液態(tài)奶在巴氏殺菌后會被來自加工環(huán)境及設(shè)施中的細(xì)菌污染[3]。阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌是影響乳制品安全常見的致病菌[4-6]。感染阪崎克羅諾桿菌會導(dǎo)致嚴(yán)重壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和腦膜炎，病死率可達(dá)40%～80%[7]。大腸桿菌是自然界中分布最廣泛的細(xì)菌，被認(rèn)為是乳制品污染的重要指標(biāo)，10～102CFU/g 的感染劑量即可致病[8]。沙門氏菌在散裝牛奶中的分離率高達(dá)11%，感染沙門氏菌會導(dǎo)致腸道疾病、妊娠中斷、休克及意志薄弱[9-10]。由于原料奶的質(zhì)量以及巴氏奶在生產(chǎn)過程中存在的污染風(fēng)險難以完全控制，因此選擇一種合適的方法并開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、實(shí)用性高的巴氏奶中致病菌的檢測技術(shù)，對于保障消費(fèi)者的安全具有重要意義。

目前，國家對食源性致病菌的檢測仍依賴于傳統(tǒng)的微生物方法，包括微生物分離、培養(yǎng)和生化鑒定，整個檢測過程需要5～7 d，然而巴氏奶保質(zhì)期一般只有3～7 d，傳統(tǒng)的微生物方法在時效上已不能滿足快速檢測的需求。為此，國內(nèi)外學(xué)者建立了食源性致病菌的多種檢測方法[11-13]，其中多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（multiple polymerase chain reaction，mPCR）方法成為乳中致病菌檢測的重要手段[14-16]。該方法快速、靈敏、特異性強(qiáng)[17]，且一次性可以同時檢測幾種病原體，為檢測的定性分析提供依據(jù)[18]。Liu 等[19]建立了一種應(yīng)用于牛奶的mPCR 方法，同時檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的靈敏度為103CFU/mL。Wei 等[20]建立mPCR 方法同時檢測牛奶中的大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，檢測靈敏度為104CFU/mL。雖然mPCR 技術(shù)在檢測乳制品中的致病菌方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些局限性。以往的研究中，對于一種致病菌，通常只選擇一種該致病菌的特異性基因來設(shè)計(jì)引物，然而，PCR 擴(kuò)增的關(guān)鍵在于靶基因的存在。如果靶基因缺失或發(fā)生突變，病原體的DNA 將無法被檢測到，這可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[21]。此外，在對退火溫度優(yōu)化選擇時，以往的研究僅根據(jù)電泳圖譜選擇一個最優(yōu)的退火溫度值，但mPCR 對退火溫度的精度要求很高，儀器老化或溫度精度偏差等原因可能會導(dǎo)致設(shè)置的退火穩(wěn)定和實(shí)際的退火溫度不一致，進(jìn)而影響檢測方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性[22-23]。因此，在實(shí)際應(yīng)用中需要進(jìn)一步完善mPCR 技術(shù)，提高其檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)際上，魯棒性是反映系統(tǒng)有能力抵抗或克服不利條件的一種方式，在生物學(xué)研究中，魯棒性意味著當(dāng)生物系統(tǒng)受到外部環(huán)境或內(nèi)部參數(shù)等不確定因素的干擾時，仍然具有保持功能穩(wěn)定性的能力[24]。因此，在mPCR 方法中，DNA 是否具有靶基因可以被看作是檢測系統(tǒng)的外部干擾，退火溫度的實(shí)際偏差影響是檢測系統(tǒng)的內(nèi)部干擾。

基于上述分析，本文對mPCR 方法進(jìn)行魯棒性研究，一方面，針對每種目標(biāo)菌都選擇了兩種不同的特異性保守基因，并設(shè)計(jì)了兩套特異引物，以減少外部環(huán)境對檢測系統(tǒng)的干擾。另一方面，在保證方法靈敏度不變的情況下優(yōu)化并確定了具有穩(wěn)定性的退火溫度范圍，以減少內(nèi)部參數(shù)對檢測系統(tǒng)的干擾。本研究方法將進(jìn)一步提高mPCR 技術(shù)的實(shí)用性，應(yīng)用于巴氏奶中阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的快速、準(zhǔn)確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎克羅諾桿菌（ATCC 51024）、大腸桿菌（ATCC 25922、UB 9002、CMCC 44752）、沙門氏菌（ATCC 14028、CMCC 50115）、李氏放線菌（ATCC 19393）、巴氏桿菌（ATCC 25923）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、霍亂弧菌（ATCC 17802）、蠟樣芽孢桿菌（ATCC 11778）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、糞腸球菌（ATCC 13433）、單增李斯特菌（ATCC 19111）均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存提供；酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、丙三醇 瓊脂奧博星生物技術(shù)公司；Gel Red 染料 沃比森科技有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest 公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、DNA Marker 2000、2×Taq PCR Mastermix（KT201）天根生化科技有限公司；TE 緩沖液（pH8.0）索萊寶科技有限公司；引物合成 上海生物工程股份有限公司；巴氏奶 購于超市。

VornadoTM 微型漩渦混合器 北京賽百奧科技有限公司；HZQ-F160 振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；GR60DA 高壓滅菌鍋 美國致微儀器公司；2-16KL 臺式冷凍離心機(jī) 德國Sigma 公司；FE28 -Standard pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；JB-CJ-1FQ 超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；HD-9704 核酸蛋白檢測儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；DYY-11 電泳儀 北京市六一儀器廠；BioSpectrum 310 凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；Veriti 96 PCR 儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將菌株接種到固體培養(yǎng)基中，37 ℃的條件下過夜培養(yǎng)活化。活化后的菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃的條件下210 r/min 振蕩過夜培養(yǎng)。通過微生物計(jì)數(shù)（所有菌株109CFU/mL）評估生長，獲得菌懸液備用。

1.2.2 DNA 模板制備及濃度測定 三種目標(biāo)菌株的菌懸液各取1 mL，使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。HD-9704 核酸蛋白檢測儀測定DNA的濃度和純度。

1.2.3 基因的選擇及引物設(shè)計(jì) 按照基因保守性及特異性原則，選擇了阪崎克羅諾桿菌的gyrB基因[25]和grxB基因[26]、大腸桿菌的uidA基因[27]和dnaE基因[28]、沙門氏菌的mgtC基因[29]和orgC的基因[30]。從NCBI 網(wǎng)站中獲取基因序列，利用Primer Premier 5.0 及Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)并評價引物。最終確定的兩套mPCR 的6 對引物序列、相應(yīng)的靶基因及預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度如表1 和表2 所示。

1.2.4 兩套mPCR 擴(kuò)增體系建立及優(yōu)化

1.2.4.1 引物濃度的優(yōu)化 配制兩個25 μL 的mPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：三種目標(biāo)菌DNA 模板各1 μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，引物（20 μmol/L）添加量分別設(shè)定為0.25、0.5、0.75、1、1.25 μL，使得引物在PCR 反應(yīng)液中的最終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 μmol/L，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 進(jìn)行30 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。同時利用ddH2O 作為mPCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。PCR 擴(kuò)增后，經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析，電泳條帶最亮則為最優(yōu)引物濃度結(jié)果。

1.2.4.2 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 配制兩個25 μL 的mPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：三種目標(biāo)菌DNA 模板各1 μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物添加量以優(yōu)化后的結(jié)果為準(zhǔn)，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 循環(huán)，循環(huán)數(shù)依次設(shè)定為25、30、35、40 進(jìn)行優(yōu)化，最后72 ℃再延伸7 min。同時利用ddH2O 作為mPCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。PCR 擴(kuò)增后，經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析，電泳條帶最亮則為最優(yōu)循環(huán)數(shù)結(jié)果。

1.2.4.3 退火溫度范圍選擇 配制兩個25 μL 的mPCR 反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：三種目標(biāo)菌DNA模板各1 μL，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物添加量以優(yōu)化后的結(jié)果為準(zhǔn)，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，退火溫度依次設(shè)定為55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5 ℃，退火時間為15 s，72 ℃延伸1 min 進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)數(shù)以優(yōu)化后的結(jié)果為準(zhǔn)，最后72 ℃再延伸7 min。同時利用ddH2O 作為mPCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。PCR 擴(kuò)增后，經(jīng)2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析，電泳條帶最亮且亮度相似則為最優(yōu)退火溫度范圍結(jié)果。

1.2.5 特異性驗(yàn)證

1.2.5.1 引物間特異性驗(yàn)證 配制兩個25 μL 的mPCR 反應(yīng)體系，模板添加情況如表3 所示，按已建立好的兩套mPCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。同時利用ddH2O作為mPCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。根據(jù)電泳圖譜中擴(kuò)增產(chǎn)物有無交叉錯配為依據(jù)，進(jìn)行引物間特異性驗(yàn)證。

表3 三種目標(biāo)菌的模板添加情況Table 3 Template addition of the three target bacteria

1.2.5.2 菌間特異性驗(yàn)證 按已建立好的檢測方法對三種目標(biāo)病原菌和八種非目標(biāo)病原菌擴(kuò)增進(jìn)行菌間特異性驗(yàn)證。以李氏放線菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、蠟樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、單增李斯特菌作為非目標(biāo)驗(yàn)證菌株，并使用ddH2O 做陰性對照。

1.2.6 靈敏度測試及溫度穩(wěn)定性驗(yàn)證

1.2.6.1 靈敏度測試 生理鹽水梯度稀釋得到范圍為109至100CFU/mL 的菌懸液，提取DNA。按已建立好的兩套mPCR 對三種目標(biāo)菌進(jìn)行靈敏度測試，第一套mPCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，59.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 進(jìn)行40 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。第二套mPCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min進(jìn)行40 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。同時利用ddH2O 作為mPCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳確定兩套mPCR 方法同時檢測三種目標(biāo)菌的靈敏度。

1.2.6.2 人工污染巴氏奶的靈敏度測試 人工污染巴氏奶，使巴氏奶中三種目標(biāo)菌的濃度分別為106～100CFU/mL，提取DNA。按已建立好的兩套mPCR 對巴氏奶中三種目標(biāo)菌進(jìn)行靈敏度測試，第一套mPCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，59.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 進(jìn)行40 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。第二套mPCR擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min進(jìn)行40 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。同時利用ddH2O 作為多重PCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳確定兩套mPCR 方法同時檢測巴氏奶中三種目標(biāo)菌的靈敏度。

1.2.6.3 溫度穩(wěn)定性驗(yàn)證 生理鹽水梯度稀釋得到濃度為103CFU/mL 至100CFU/mL 的菌懸液和巴氏奶，提取DNA 作為溫度穩(wěn)定性驗(yàn)證模板。按已建立好的兩套mPCR 方法對驗(yàn)證模板進(jìn)行擴(kuò)增，第一套mPCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，驗(yàn)證的退火溫度為59、58.5、58 ℃，退火時間為15 s，72 ℃延伸1 min 進(jìn)行40 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。第二套mPCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，驗(yàn)證的退火溫度為58.5、58、57.5 ℃，退火時間為15 s，72 ℃延伸1 min 進(jìn)行40 個循環(huán)，最后72 ℃再延伸7 min。同時利用ddH2O 作為mPCR 反應(yīng)體系陰性對照模板。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳確定在靈敏度一致的前提下，具有穩(wěn)定性的退火溫度范圍。

1.2.7 檢測50 份人工污染的巴氏奶的方法評價 三種不同濃度的目標(biāo)菌組合后人工污染到50 份巴氏奶中，其中三種目標(biāo)菌組合污染32 份，兩種目標(biāo)菌組合污染12 份，單種目標(biāo)菌污染6 份。其中阪崎克羅諾桿菌污染總份數(shù)為42 份，大腸桿菌污染總份數(shù)為42 份，沙門氏菌污染總份數(shù)為42 份。采用本研究方法和國標(biāo)方法GB 4789.40-2016、GB 4789.38-2012、GB 4789.4-2016 進(jìn)行同步檢測，并對檢測結(jié)果及檢測時效進(jìn)行評價。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜均由美國UVP 公司的BioSpectrum 310 凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)生，后由Visio 2003 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩套mPCR 擴(kuò)增程序的優(yōu)化

2.1.1 引物濃度優(yōu)化 引物的濃度是影響mPCR 中條帶擴(kuò)增的關(guān)鍵，引物濃度偏低會降低目標(biāo)DNA 的擴(kuò)增程度，引物濃度偏高會出現(xiàn)其他非特異性條帶[31]。本研究在對引物濃度優(yōu)化時，將每一套mPCR 反應(yīng)體系中的三對引物設(shè)置為同一濃度，避免因某引物的濃度明顯高于其他引物的濃度所產(chǎn)生的引物間競爭性抑制[32]。且在同一PCR 反應(yīng)體系中使用多對引物會增加形成引物二聚體的概率，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們根據(jù)六對引物設(shè)計(jì)了兩套mPCR 反應(yīng)體系，以減少引物之間的相互干擾，從而提高mPCR 反應(yīng)的準(zhǔn)確性和可靠性。第一套mPCR 擴(kuò)增程序的引物濃度優(yōu)化結(jié)果如圖1a 所示，泳道1 中擴(kuò)增出的條帶亮度最大，因此gyrB、uidA和mgtC的最佳引物濃度組合為0.2 μmol/L。第二套mPCR 擴(kuò)增程序的引物濃度優(yōu)化結(jié)果如圖1b 所示，泳道1 中擴(kuò)增出的條帶亮度最大，因此grxB、dnaE和orgC的最佳引物組合為0.2 μmol/L。

圖1 引物濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Result of primer concentrations seleted

2.1.2 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化 循環(huán)數(shù)過低會導(dǎo)致目標(biāo)PCR 產(chǎn)物低，循環(huán)數(shù)過高則會導(dǎo)致非特異性條帶的出現(xiàn)，通常來講循環(huán)數(shù)一般在25～40 之間。第一套mPCR 擴(kuò)增程序的循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果如圖2a 所示，泳道4 中擴(kuò)增出的條帶亮度最大，且均未出現(xiàn)其他非特異性條帶，因此第一套mPCR 擴(kuò)增程序中循環(huán)數(shù)設(shè)置為40 是最佳選擇。第二套mPCR 擴(kuò)增程序的循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果如圖2b 所示，泳道4 中擴(kuò)增出的條帶亮度最大，且均未出現(xiàn)其他非特異性條帶，因此第二套mPCR 擴(kuò)增程序中循環(huán)數(shù)設(shè)置為40 是最佳選擇。

圖2 循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Result of cycles seleted

2.1.3 退火溫度范圍的優(yōu)化選擇 退火溫度是PCR程序的關(guān)鍵，影響著方法的特異性和敏感性[33]。第一套mPCR 退火溫度范圍的優(yōu)化結(jié)果如圖3a 所示，泳道7、泳道8、泳道9、泳道10 亮度程度相似且最亮，因此，第一套mPCR 退火溫度選擇58～59.5 ℃。第二套mPCR 退火溫度范圍的優(yōu)化結(jié)果如圖3b 所示，泳道6、泳道8、泳道9、泳道10 亮度程度相似且最亮，因此，第二套mPCR 退火溫度選擇57.5～59 ℃。

2.2 特異性驗(yàn)證

2.2.1 引物間特異性驗(yàn)證 對已建立好的兩套mPCR 擴(kuò)增程序進(jìn)行引物間特異性驗(yàn)證，第一套mPCR 引物間特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖4a 所示，泳道1 中擴(kuò)增出了含有三種目標(biāo)菌的條帶，泳道2～4 中擴(kuò)增出了兩種目標(biāo)菌任意組合相應(yīng)的條帶，泳道5～7 中分別擴(kuò)增出單種目標(biāo)菌相應(yīng)的條帶，泳道8 陰性對照無擴(kuò)增條帶。第二套mPCR 引物間特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖4b 所示，泳道1～3 中分別擴(kuò)增出單種目標(biāo)菌相應(yīng)的條帶，泳道4～6 中擴(kuò)增出了兩種目標(biāo)菌任意組合相應(yīng)的條帶，泳道7 中擴(kuò)增出了含有三種目標(biāo)菌的條帶，泳道8 陰性對照無擴(kuò)增條帶。本研究所設(shè)計(jì)的引物在PCR 反應(yīng)擴(kuò)增中無交叉錯配現(xiàn)象，且無其他非特異性條帶出現(xiàn)，驗(yàn)證結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性。

圖4 引物間的特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Result of specificity validation between primers

2.2.2 菌間特異性驗(yàn)證 對已建立的兩套mPCR 擴(kuò)增程序進(jìn)行菌間特異性驗(yàn)證。第一套mPCR 擴(kuò)增程序菌間特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖5a 所示，泳道1 中同時擴(kuò)增出三種目標(biāo)菌的特異性片段，阪崎克羅諾桿菌429 bp、大腸桿菌129 bp、沙門氏菌339 bp，且無非目標(biāo)菌擴(kuò)增條帶，泳道2～4 中無非目標(biāo)菌擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，泳道5 陰性對照無擴(kuò)增條帶。第二套mPCR擴(kuò)增程序菌間特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖5b 所示，泳道1 中同時擴(kuò)增出三種目標(biāo)菌的特異性片段，阪崎克羅諾桿菌288 bp、大腸桿菌441 bp、沙門氏菌144 bp，且無非目標(biāo)菌擴(kuò)增條帶，泳道2～4 中無非目標(biāo)菌擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，泳道5 陰性對照無擴(kuò)增條帶。可見，已建立的兩套mPCR 擴(kuò)增程序具有良好的特異性。

圖5 菌間特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Result of inter-bacterial specificity verification

2.3 mPCR 的靈敏度和溫度穩(wěn)定性驗(yàn)證

測定已建立好的兩套mPCR 擴(kuò)增程序同時檢測三種目標(biāo)菌的靈敏度及確定不改變方法靈敏度的情況下具有穩(wěn)定性的退火溫度范圍。如圖6a 所示，退火溫度為59.5 ℃時第一套mPCR 同時檢測三種目標(biāo)菌的靈敏度均為10 CFU/mL；如圖6b 所示，58～59 ℃的退火溫度范圍內(nèi)均可以保證同時檢測三種目標(biāo)菌的靈敏度為10 CFU/mL，因此第一套mPCR方法可在退火溫度58～59.5 ℃（溫差為1.5 ℃）的范圍內(nèi)有效擴(kuò)增。如圖6c 所示，退火溫度為59 ℃時第二套mPCR 同時檢測三種目標(biāo)菌的靈敏度均為10 CFU/mL；如圖6d 所示，57.5～58.5 ℃的退火溫度范圍內(nèi)均可以保證同時檢測三種目標(biāo)菌的靈敏度為10 CFU/mL，因此第二套mPCR 方法可在退火溫度57.5～59 ℃（溫差為1.5 ℃）的范圍內(nèi)有效擴(kuò)增。

圖6 靈敏度和溫度穩(wěn)定性測定結(jié)果Fig.6 Result of sensitivity and temperature stability detected

2.4 人工污染的巴氏奶測定

測定已建立好的兩套mPCR 方法同時檢測巴氏奶中三種目標(biāo)菌靈敏度及確定不改變方法靈敏度的情況下具有穩(wěn)定性的退火溫度范圍。如圖7a 所示，退火溫度為59.5 ℃時第一套mPCR 同時檢測巴氏奶中三種目標(biāo)菌的靈敏度均為10 CFU/mL；如圖7b所示，59 ℃的退火溫度可以保證同時檢測巴氏奶三種目標(biāo)菌的靈敏度為10 CFU/mL，而在58.5 ℃、58 ℃的退火溫度下不能保證方法靈敏度均為10 CFU/mL，因此第一套mPCR 方法檢測巴氏奶樣品時可在退火溫度59～59.5 ℃（溫差為0.5 ℃）的范圍內(nèi)有效擴(kuò)增。通過比較，巴氏奶中得到的溫差范圍結(jié)果比菌懸液中小1 ℃。根據(jù)圖7c 所示，當(dāng)退火溫度為59 ℃時，第二套mPCR 同時檢測巴氏奶中三種目標(biāo)菌的靈敏度均為10 CFU/mL，但在擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)了非特異性條帶。與此不同的是，在圖6c 中退火溫度為59 ℃時菌懸液擴(kuò)增并沒有出現(xiàn)這樣的結(jié)果。因此，第二套mPCR 方法檢測巴氏奶中目標(biāo)菌時退火溫度不宜設(shè)置為59 ℃。在圖7d 中，57.5～58.5 ℃的退火溫度范圍內(nèi)均可以保證同時檢測巴氏奶中三種目標(biāo)菌的靈敏度為10 CFU/mL，且未出現(xiàn)非特異性條帶。因此第二套mPCR 方法的退火溫度選擇57.5～58.5 ℃（溫差為1 ℃），以獲得更可靠的結(jié)果。通過比較巴氏奶和菌懸液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管在mPCR 方法建立時第一套mPCR 方法在退火溫度58～59.5 ℃范圍內(nèi)以及第二套mPCR 方法在退火溫度57.5～59 ℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出同樣的擴(kuò)增潛力，但將該方法實(shí)際應(yīng)用到巴氏奶中退火溫度范圍結(jié)果卻有所減小。說明巴氏奶中存在多種干擾成分如較高的脂肪和蛋白質(zhì)會導(dǎo)致PCR 反應(yīng)體系的復(fù)雜性增加，對擴(kuò)增結(jié)果會產(chǎn)生不利影響，從而影響了退火溫度的穩(wěn)定性[22]。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究對mPCR方法退火溫度范圍優(yōu)化的必要性，以保證方法的穩(wěn)定性和靈敏度。近年來，許多學(xué)者利用mPCR 方法檢測不同食品中的致病菌。Abdeen 等[15]利用mPCR檢測技術(shù)對人工染菌牛奶樣品中6 種致病菌進(jìn)行檢測，在退火溫度為55 ℃的條件下檢測靈敏度為103CFU/mL；姜華等[34]建立一種能夠同時檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的mPCR 檢測方法，在退火溫度為55 ℃的條件下檢測靈敏度為103CFU/mL；楊國興等[35]建立一種mPCR 快速檢測肉制品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌和單增李斯特菌的分析方法，在退火溫度為56.6 ℃的條件下檢測靈敏度為103CFU/mL。本研究建立的魯棒性檢測方法的靈敏度與其相比提高了兩個數(shù)量級，且本研究方法建立優(yōu)化了兩套mPCR 反應(yīng)體系，對檢測的結(jié)果提供了雙重保護(hù)。

圖7 人工污染巴氏奶的靈敏度和溫度穩(wěn)定性測定結(jié)果Fig.7 Result of sensitivity and temperature stability detected in pasteurized milk

2.5 魯棒性mPCR 方法和國標(biāo)方法檢測結(jié)果的評價和比較

魯棒性mPCR 方法和國標(biāo)方法GB 4789.40-2016、GB 4789.38-2012、GB 4789.4-2016 同時檢測50 份人工污染的巴氏奶樣品的結(jié)果如表4 所示。兩種方法檢測出阪崎克羅諾桿菌顯現(xiàn)陽性的樣品數(shù)量均為42 件，檢出率均為84%；檢測出大腸桿菌顯現(xiàn)陽性的樣品數(shù)量均為42 件，檢出率均為84%；檢測出沙門氏菌顯現(xiàn)陽性的樣品數(shù)量均為42 件，檢出率均為84%。本研究建立的方法與國標(biāo)方法相比較，敏感性、特異性和符合率相同，分別為100%、100%、100%。在檢測時效上，本研究方法整個過程需要4 h，包括PCR 反應(yīng)液配置、擴(kuò)增、電泳，國標(biāo)檢測方法需要62～148 h，包括細(xì)菌培養(yǎng)和后續(xù)的生化檢測。因此，本研究建立的魯棒性mPCR 方法在檢測時效上和國標(biāo)法相比具有明顯優(yōu)勢。

表4 50 份人工污染的巴氏奶樣品檢測結(jié)果Table 4 Test results of 50 artificially contaminated pasteurized milk samples

3 結(jié)論

本研究建立了一種魯棒性mPCR 方法，可用于檢測巴氏奶中的阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌。該方法不僅提高了常規(guī)mPCR 方法的實(shí)用性，還解決了巴氏奶貨架期短與致病菌傳統(tǒng)檢測方法耗時長相矛盾的問題。經(jīng)過優(yōu)化和魯棒性研究，該方法檢測結(jié)果得到雙重保護(hù)，且確定了具有穩(wěn)定性的退火溫度范圍，保證了方法的穩(wěn)定性和實(shí)用性。與國標(biāo)方法GB 4789.40-2016、GB 4789.38-2012、GB 4789.4-2016 相比，魯棒性mPCR 方法具有明顯的時效優(yōu)勢，為乳品行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供了更加及時的檢測手段。因此，本研究在理論和實(shí)用方面都具有重要價值。然而，對于實(shí)際檢測過程中存在巴氏奶中致病菌污染小于10 CFU/mL 的情況，本研究建立的魯棒性mPCR 方法可以結(jié)合預(yù)增菌步驟獲得活菌足量且雜質(zhì)較少的培養(yǎng)物進(jìn)行檢測。此外，由于不同乳制品中成分的差異性會影響方法的檢測效果，因此對于其他類型的乳制品如酸奶、奶粉等中的致病菌污染問題，本研究提出的方法未來仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證及改進(jìn)。