牡丹雄蕊對慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的影響

程丹丹，高德民，王岱杰，梁 棟，龐志勇，徐亞振，王惠敏，袁文鵬,

（1.齊魯工業大學（山東省科學院），山東省科學院菏澤分院，山東省生物工程技術創新中心，山東菏澤 274000；2.山東中醫藥大學藥學院，山東濟南 250355；3.菏澤牡丹產業技術研究院，山東菏澤 274000）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）是毛茛科植物，主要分布在山東、河南、陜西、安徽等地。近年來牡丹產業發展迅速，牡丹系列深加工產品研發和生產得到大力發展，牡丹根皮、牡丹籽得到了深入開發應用。牡丹的雄蕊部分營養極為豐富，富含多種活性成分如活性多糖、蛋白質、芍藥苷、α-亞麻酸、兒茶素等[1-2]，另外含有多種礦物質元素、維生素、氨基酸等[3-4]，是一種極佳的天然保健食品原料。目前，對于牡丹花蕊的研究主要集中在牡丹花蕊的化學成分、營養價值和抗氧化活性方向[5]，關于牡丹花蕊功能性評價方面的研究較少，由于缺少基礎理論支撐，市場上主要將牡丹雄蕊經過傳統方式制成牡丹花蕊茶等一般食品被食用，造成了牡丹雄蕊沒有得到充分的開發應用，從而造成了大量的資源浪費。

慢性非細菌性前列腺炎是指由于非細菌感染因素導致的患者長期、反復的骨盆區域疼痛或不適、排尿異常（可表現為尿急、尿頻、尿痛和夜尿增多等）等癥狀的疾病[6-7]。由于慢性疼痛久治不愈，患者生活質量下降，并可能有性功能障礙、焦慮、抑郁、失眠、記憶力下降等[8-9]。慢性非細菌性前列腺炎目前以抗生素類藥物治療為主，植物提取物制劑在慢性非細菌性前列腺的應用中逐漸得到重視，療效評價主要以緩解疼痛、改善排尿癥狀等為主[10-11]。但是，目前效果明顯的植物制劑較少。

通過初步對經常飲用牡丹花蕊茶的人群（約50 例）開展調查，發現長期飲用牡丹花蕊茶能明顯緩解尿急、尿頻、尿痛和夜尿增多等癥狀，特別是對中老年人效果更佳顯著。為了探究牡丹雄蕊在治療前列腺炎方面的功效價值，實驗采用去勢+皮下注射激素（苯甲酸雌二醇）誘導的慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型，開展體內藥效學實驗，評價牡丹雄蕊提取物治療慢性非細菌性前列腺炎的藥效作用。以期為其作為新型功能性食品，以及藥用價值的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 大鼠 雄性，50 只，體重為（220±10）g，周齡為（6±1）周，采購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號SCXK（魯）20180007，飼養于煙臺拉斐爾生物科技有限公司SPF 級動物房，實驗動物使用許可證號SCXK（魯）20170026。實驗動物飼養管理的環境條件為室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，12/12 h 明暗交替。動物飼養于標準的大鼠塑料盒中，每籠5 只。觀察動物的活動、飲食等表現進行檢疫檢查，檢疫合格的動物方可用于試驗。檢疫期及實驗期間，大鼠自由攝食、飲水；飼料 為SPF 級大鼠生長繁育飼料，采購于江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司，生產許可證號蘇飼證（2019）01008；苯甲酸雌二醇 索萊寶有限公司；塞來昔布 菏澤聯眾醫藥連鎖藥店；牡丹雄蕊 采自菏澤市牡丹區劉集村油用牡丹種植基地（35°22' 19"N；115°33' 28"E）；蘇木精染色液 無錫市江原實業技貿總公司；伊紅染液（醇溶性）珠海貝索生物技術有限公司；中性樹膠中國上海懿洋儀器有限公司；血栓素B2 ELISA 試劑盒、6-酮-前列腺素F1αELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、PGE2、白細胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒等 山東沃恩生物科技有限公司。

YP5001 電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司；TG20-WS 冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司；DHJ-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；RSJ-1A 組織染色機、ZKPJ-1A 攤烤片機、BMJ-1B 包埋儀 天津愛華醫療器械有限公司；Axio Scope 生物顯微鏡 上海佑科儀器儀表有限公司；HVS-1300-U 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Histocore Biocut 切片機 德國Leica 公司；Versa Max 酶標儀 美谷分子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 隨機選取42 只大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，無菌條件下進行去勢手術，然后全層縫合，消毒包扎。行去勢手術的大鼠于第3 d 每日背部皮下注射苯甲酸雌二醇（0.25 mg·kg-1），連續30 d，造模后抽取2 只大鼠進行病理學檢查，分析慢性非細菌性前列腺炎的模型情況[12-13]。實驗方案經山東省科學院菏澤分院實驗動物倫理委員會審查批準。

1.2.2 分組及給藥 將造模成功的SD 大鼠隨機分成5 組，每組8 只，給藥劑量及次數根據中藥藥理學等效劑量系數折算法換算[14-15]，即模型組，陽性組（塞來昔布組250 mg·kg-1），牡丹雄蕊凍干粉低、中、高劑量組（100、200、400 mg·kg-1），1 次/d，連續30 d，另外8 只未經造模的大鼠作為空白對照組，空白組和模型組給予等量生理鹽水[13]。

1.2.3 前列腺病理檢查 大鼠末次給藥1 h 后，摘取眼球取血后處死大鼠，迅速解剖。大鼠解剖后迅速取出新鮮的前列腺組織，各組隨機選取一部分前列腺組織用4%的甲醛固定，二甲苯脫水，常規石蠟包埋，切片，HE 染色，制備病理組織切片。觀察大鼠前列腺間質增生、炎細胞浸潤及腺體、腺腔數量與形態學變化情況[16]。

1.2.4 大鼠前列腺指數及卵磷脂小體密度檢測 用電子分析天平精密稱重前列腺，并計算前列腺指數（mg·g-1）[13]。將剩余部分前列腺組織迅速按摩，取出15 μL 前列腺液于顯微鏡下計數白細胞，另取15 μL前列腺液涂片，于顯微鏡下觀察卵磷脂小體密度并按以下臨床檢驗標準記錄。標準分為4 級（滿視野為4 級，3/4 視野為3 級，1/2 視野為2 級，1/4 視野為1 級）。

1.2.5 血液及組織中生化指標檢測 眼球取血，2 h后離心，離心時間為10 min，轉速為3000 r/min，然后將移吸管吸出分離的血清，置于4 ℃冰箱保存備用。測定血清中血栓素B2（TXB2）以及6-酮-前列腺素F1α（6-K-PGF1α）的含量；將大鼠前列腺組織勻漿，制成0.5 g/mL 濃度[17]，按試劑盒說明操作，ELISA 法測定大鼠前列腺組織中ICAM-1、INF-γ、TNF-α、PGE2、IL-8 和MCP-1 的含量，并采用比色法測定大鼠前列腺組織NO 含量。

1.2.6 免疫組織化學檢測各組大鼠前列腺組織NFκB 表達 將石蠟包埋的大鼠前列腺組織切片脫蠟后與3%的過氧化氫孵育10 min，然后加入0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液后，用山羊血清封閉。室溫下孵育15 min，然后加入抗NF-κB/P65 抗體，4 ℃孵育12 h 后加入IgG，37 ℃溫育15 min。用DAB 染色，蘇木精復染，1%鹽酸鹽和乙醇進行分色，洗滌25 min后進行檢測分析，根據陽性表達強度進行分級，不表達為0，弱表達為1，中度表達為2，強表達為3，計算平均值（n=3）[18-19]。

1.3 數據處理

實驗所有的數據均用SPSS16.0 統計軟件進行處理，數據用均值±標準差來表示，組間差異按照t檢驗法進行檢驗，結果以P＜0.05 時有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 大鼠模型的建立

對造模后大鼠前列腺腺體觀察，發現大鼠前列腺腺體發生腫大，腺體質地堅硬，與周圍組織粘連。與空白對照組比較，模型組大鼠腺體中的炎癥細胞浸潤現象嚴重。以上觀察提示，去勢聯合注射苯甲酸雌二醇成功誘導了大鼠非細菌性前列腺炎模型。

2.2 牡丹雄蕊對前列腺病理組織的影響

由圖1 可知，前列腺病理檢查發現模型組腺泡上皮細胞變性；大部分腺泡擴張，腔內見大量混合有炎性細胞的分泌物，并見細胞壞死；間質內見單核細胞浸潤。陽性藥物組僅見部分腺泡擴張，腔內分泌物增多；但腺泡腔未見明顯的炎性細胞浸潤。低劑量組見腺泡上皮細胞變性；大部分腺泡擴張，腔內見大量分泌物，混合有少量炎性細胞；間質內見與模型組相似的單核細胞浸潤。中劑量組見腺泡上皮細胞變性；腺泡擴張不明顯，腔內僅見少量分泌物，少量炎性細胞；間質內見與模型組相似的單核細胞浸潤。高劑量組見腺泡上皮未見明顯異常，腺泡擴張不明顯；間質內見與模型組相似的單核細胞浸潤。

圖1 各組大鼠前列腺組織病理切片（HE 染色）Fig.1 Pathological sections of prostate tissue of rats in each group (HE staining)

2.3 牡丹雄蕊對大鼠卵磷脂小體密度的影響

由表1 可知，模型組大鼠的卵磷脂小體密度顯著低于空白組（P＜0.01），表明模型組中巨噬細胞吞噬了大量脂類。與模型組比較，牡丹雄蕊各劑量組能顯著提高卵磷脂小體密度（P＜0.01，P＜0.05），表明牡丹雄蕊各劑量組中巨噬細胞減少。牡丹雄蕊各劑量組卵磷脂小體密度均低于陽性組，牡丹雄蕊各劑量中高劑量組卵磷脂小體密度最高，表明牡丹雄蕊可以緩解前列腺炎的癥狀，且緩解效果與牡丹雄蕊的劑量有關。

表1 牡丹花蕊對大鼠卵磷脂小體密度的影響Table 1 Effect of peony stamen on lecithin corpuscle density in rats

2.4 牡丹雄蕊對大鼠前列腺重、前列腺指數及白細胞數的影響

表2 可知，與空白組比較，模型組白細胞數、前列腺重和前列腺指數均顯著或極顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）；陽性組及各給藥組與模型組比較，均能顯著或極顯著降低大鼠前列腺液中白細胞數、前列腺重和前列腺指數（P＜0.01，P＜0.05），牡丹雄蕊高劑量組降低效果最明顯，表明牡丹雄蕊能降低前列腺炎大鼠前列腺液中白細胞數，緩解前列腺腫脹度，且作用效果與牡丹雄蕊的劑量有關。

表2 各組大鼠體質量、腺體質量、前列腺指數及白細胞數Table 2 Body mass,gland mass,prostatic index and white blood cell count in rats in each group

2.5 牡丹雄蕊對前列腺組織中細胞因子含量的影響

由表3 可知，與空白組比較，模型組前列腺組織中ICAM-1、PGE2、TNF-α、IL-8 及MCP-1 的表達均極顯著升高（P＜0.01），INF-γ的含量略升高但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各給藥組PGE2 表達極顯著降低（P＜0.01）；ICAM-1、INF-γ、TNF-α和MCP-1 的表達也均顯著降低（P＜0.05），但中劑量組和低劑量組降低不明顯，僅高劑量組有顯著性差異（P＜0.05）；各給藥組IL-8 的表達也均有下降，高劑量組降低極顯著（P＜0.01）。結果表明，牡丹雄蕊能降低PGE2、TNF-α、IL-8、MCP-1 的表達，且有明顯的量效關系。

表3 各組大鼠前列腺組織中ICAM-1、INF-γ、PGE2、TNF-α、IL-8 及MCP-1 的含量Table 3 Contents of ICAM-1,INF-γ,PGE2,TNF-α,IL-8 and MCP-1 in prostate tissue of rats in each group

2.6 牡丹雄蕊對前列腺組織中NO 含量的影響

由圖2 可知，與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織中NO含量極顯著降低（P＜0.01），其余各組也有所降低，但低劑量組和中劑量組有顯著性差異（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組NO 含量均升高，其中高劑量組中NO 含量升高極顯著（P＜0.01），略高于陽性對照組。

圖2 各組大鼠前列腺組織NO 的含量Fig.2 NO contents in prostate tissue of rats in each group

2.7 牡丹雄蕊對血液中TXB2 和6-K-PGF1α 的表達的影響

表4 可知，與空白組比較，各組血液中TXB2 表達極顯著升高，各給藥組與模型組比較TXB2 表達顯著極降低（P＜0.01），且有顯著量效關系；與空白組比較，各組血液中6-K-PGF1α表達顯著極降低（P＜0.01），各給藥組與模型組比較6-K-PGF1α表達均明顯升高，其中，高劑量組6-K-PGF1α表達升高較顯著，接近陽性對照組。

表4 各組大鼠血液中TXB2 和6-K-PGF1α 表達水平Table 4 TXB2 and 6-K-PGF1α expression levels in blood of rats in each group

2.8 牡丹雄蕊對大鼠前列腺組織NF-κB 表達的影響

由圖3 可知，與空白組比較，牡丹雄蕊各劑量組NF-κB 陽性表達增強，均有顯著性差異（P＜0.01），與模型組比較，牡丹花蕊各劑量組NF-κB 陽性表達減弱，且有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），牡丹花蕊高劑量組陽性表達水平與陽性組接近，牡丹花蕊中劑量組與低劑量組陽性表達未顯示出表達水平與治療劑量的相關性。

圖3 各組大鼠前列腺組織NF-κB 的表達水平（IHC）Fig.3 NF-κB expression in prostate tissue of rats in each group (IHC)

3 討論與結論

從各組前列腺的病理組織學觀察可知，模型組腺泡上皮細胞變性、分泌物增加并伴有炎性細胞滲出等，間質以炎性細胞浸潤為主。與模型組比較，腺泡上皮細胞變性的嚴重程度和腺泡腔內的分泌物量及其伴有炎性細胞滲出數量降低；與陽性組比較，各劑量牡丹雄蕊組腺泡上皮細胞變性的嚴重程度和腺泡腔內的分泌物量及其伴有炎性細胞滲出數量均較明顯；各劑量組之間比較，細胞變性嚴重程度和腺泡腔內分泌物量：低劑量＞中劑量＞高劑量。

ICAM-1 是一種重要的細胞表面黏附分子，它介導的細胞黏附是機體正常防御系統得以存在和維持功能的重要基礎，但組織細胞ICAM-1 的持久或增強表達又可導致組織器官的炎癥免疫損傷[20]。INF-γ主要由活化T 細胞和NK 細胞產生，有廣泛的免疫調節作用。MCP-1 對單核/巨噬細胞有很強的趨化活性，在介導炎癥的發生和發展中起關鍵作用，可提高單核細胞和內皮細胞之間的黏附，并介導單核細胞的趨化和活化，促進單核細胞穿過內皮屏障，分泌多種生物活性物質引起組織的損傷[21]。TNF-α是非常重要的促炎性細胞因子，在多種炎性反應中都起著至關重要的作用，可調節機體免疫反應、炎癥反應、內毒素調節。PGE2 可以使機體擴大炎癥疼痛，造成局部水腫[22]。TNF-α、IL-8 參與MMP-9 的表達調節，進而降解細胞外基質，使粒細胞更快地到達間質中參與炎癥反應，加重非細菌性前列腺炎的癥狀[23]。正常情況下內皮源性NO 具有抑制炎癥反應的作用，病理情況下誘導型NO 合成酶合成大量的NO 則有細胞毒作用加重炎癥反應[24]。實驗表明牡丹雄蕊可通過降低前列腺組織異常升高的ICAM-1、MCP-1 水平，降低NO 含量，降低TNF-α、PGE2 和IL-8 因子水平，抑制炎性細胞的遷移、黏附，阻止其穿越血管內皮細胞，減輕炎性細胞對前列腺組織的浸潤，最終減少炎性介質在前列腺組織的釋放，減輕前列腺組織的炎癥免疫損傷[18-21]。揭示牡丹雄蕊可緩解前列腺組織炎癥，減輕疼痛及前列腺組織的損傷。

TXB2 是前列腺素中的一種，主要作用為促進血小板聚集和收縮血管，當其水平增高會使血小板大量聚集形成瘀血[25]。6-keto-PGF1α是由血管內皮細胞產生的PGI2 代謝出來，在正常的生理狀態下，TXB2和PGI2 的水平處于相對平衡狀態。當有生物活性物質刺激血小板時，花生四烯酸代謝合成大量TXB2，并產生大量能抑制PGI2 合成酶活性的自由基脂質過氧化物，使PGI2 合成相應減少，導致血中PGI2/TXB2 的平衡失調[7,26]。與空白對照組相比，模型組的大鼠血漿中TXB2 水平顯著升高以及6-keto-PGF1α水平顯著降低。說明前列腺遭到一定程度的破壞，致使TXB2 大量釋放，6-keto-PGF1α分泌減少，出現了失衡狀態。與模型組相比，各劑量牡丹雄蕊組均能降低TXB2 水平，升高6-keto-PGF1α水平，尤其牡丹雄蕊高劑量效果較顯著。揭示牡丹雄蕊對慢性非細菌性前列腺炎大鼠模型的血液循環障礙有緩解作用。NF-κB 因子作為調節炎癥反應和免疫反應的關鍵核轉錄因子，在多種炎癥信號通路中發揮著重要作用[27]。NF-κB 的激活導致前列腺炎組織中TNF-α和IL-1β表達升高[28]。

綜上所述，牡丹雄蕊可減輕模型組前列腺炎大鼠前列腺的腫脹度，對血液及前列腺組織中炎癥因子有調節作用，可顯著降低促炎性細胞因子水平，抑制前列腺組織中的炎癥反應，改善前列腺組織病理狀態，對慢性非細菌性前列腺炎具有較好的功效，本實驗對牡丹雄蕊在功能性食品，甚至藥品方向的開發應用提供了理論依據。