羊乳酪蛋白2 種不同膜分離方法比較研究

李欣雨，孟毅，賀寶元，周妍，魏怡，連嚴慧，張磊，土雙靜，薛海燕

（1.陜西科技大學食品科學與工程學院，西安 710021；2.陜西科技大學輕工科學與工程學院，西安 710021；3. 陜西金牛乳業有限公司，陜西 渭南 714000）

0 引 言

羊乳成分被公認為最接近人乳[1]，因其自身超高的營養價值和獨特的風味被譽為“奶中之王”[2]，因此羊乳成為了嬰幼兒配方奶粉的良好原料[3]。要實現羊乳成分的母乳化調配通常需要降低羊乳總蛋白的含量，減少酪蛋白增加乳清蛋白以此來改善二者比例，所以羊乳中分離酪蛋白是組分化生產羊乳的關鍵[4]。目前，分離酪蛋白最常見的方法為酶法沉淀和酸法沉淀，但酶法和酸法分離酪蛋白容易受到pH 和溫度的影響，使得酪蛋白的持水性較差，鹽離子濃度的增加也會減弱酪蛋白的乳化性和乳化穩定性[5]。膜分離技術是在分子水平上不同粒徑分子的混合物在透過半透膜時，實現選擇性分離的技術[6]。膜分離技術是物理過程，所以具有能耗低、效率高、操作條件溫和、對熱和酸的敏感性較低等優點，適合于處理熱敏物質[7]。通過膜分離技術制備的酪蛋白膠束粉的天然結構不會被破壞，溶解度更好，同時乳清粉的變性程度也較低[8]。利用膜分離技術生產的羊乳清粉，其營養價值高，功能性優良，可廣泛用于嬰幼兒配方奶粉、功能性食品等領域[9]，截留液中的酪蛋白也可用于生產干酪制品。

國內，張雨萌等[10]通過膜分離建立了牛羊乳酪蛋白和乳清蛋白的分離效果對比研究；李志賓等[11]利用膜分離提取牛乳中乳清蛋白，在一定程度上保護了乳清蛋白中的生物活性成分；陳建行等[12]通過比較100 nm和40 nm 孔徑的陶瓷膜對酪蛋白和乳清蛋白的分離效果，發現40 nm 孔徑的陶瓷膜能夠更好得到清澈透明的乳清。ZULEWSKA J 等[13]在50 ℃的條件下得出，聚合物膜與陶瓷膜相比對血清蛋白的截留率更高；HURT E 等[14]在50 ℃條件下將牛乳用陶瓷膜恒壓微濾，使得乳清蛋白的脫除率達到98.3%[15]，而目前有關羊乳的膜分離技術研究還較少。

本研究采用不同孔徑的中空纖維膜和卷式有機膜對脫脂羊乳進行分離，其中截留液可用于制作酪蛋白膠束粉或者干酪產品，滲透液則可用于制備高品質的乳清蛋白產品[15]。對微濾過程中膜通量、料液組分構成、pH 值、電導率值、顏色、脫除率和膜的污染與清洗等方面進行分析，評估量化膜截留酪蛋白的能力。并對透過液和截留液分別進行濃縮、噴霧干燥，期望能夠獲得純度較高的酪蛋白膠束粉，為工業化生產羊乳基料提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮液態羊乳，陜西金牛乳業有限公司；小牛皺胃酶，上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸（分析純），南昌市昌九化工廠；無水氯化鈣，天津市恒興化學試劑制造有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），美國Amersham 公司；β-巰基乙醇，普洛麥格（北京）生物技術有限公司；N,N,N',N'-四甲基乙二胺，上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍R-250，加拿大Bio Basic 公司；濃鹽酸，北京化學試劑廠；冰醋酸，廣州化學試劑廠；無水硫酸鉀，天津科密歐公司；無水硫酸銅，天津天力化學試劑公司；四甲基乙二胺（TEMED），美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機（HC-3018R），安徽中科中佳科學儀器有限公司；電導率儀，上海般特儀器制造有限公司；pH 計（PB-10），賽托利斯科學儀器（北京）有限公司；卷式有機膜過濾裝置，同舟縱橫（廈門）流體有限公司；中空纖維素膜，美國通用電氣公司；移液槍（Transferpette），德國BRAND 公司；蛋白質電泳儀，南京新校園生物技術研究所；穩壓電源，鴻寶電氣股份有限公司；半自動凱式定氮儀（KN780），阿爾瓦儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膜過濾操作、樣品pH 值和電導率的測定

1.3.1.1 膜參數及切向流過濾原理

膜基本參數如表1 所示。

表1 膜基本參數

切向流過濾與直流過濾原理不同，其原理如圖1所示，過濾速度能在相對長的一段時間里保持在一個較高的水平，可以實現連續化運行，工業生產過程主要使用切向流過濾。

圖1 切向流

1.3.1.2 中空纖維膜過濾操作流程

首先將800 mL 脫脂鮮羊乳加入物料罐中，打開電源后開泵，設備運行30 s 后調節進口壓力閥（137.9 kPa)，設備繼續運行1 min 平穩后開始計時收集所需樣品。在透過液管下端放置第一個燒杯收集透過液1 min，之后每間隔2 min 更換燒杯收集1 min，將收集液按順序進行編號1.2.3……。每個時段收集結束，立即測定每一個燒杯中透過液的體積、pH 和電導率，同時再將每個燒杯中的透過液混勻以觀察顏色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均勻后立即測定pH 和電導率，測定后立即倒回物料罐混勻，每2 min 循環一次。循環操作直至物料罐中樣品達到物料罐最小容納體積量（200 mL）時關泵。

1.3.1.3 卷式有機膜過濾操作流程

首先將4 000 mL 脫脂鮮羊乳加入物料罐中，打開電源后開泵，設備運行30 s 后調節進口壓力閥（25 kPa)，設備繼續運行1 min 平穩后開始計時收集所需樣品。在透過液管下端放置第一個燒杯收集透過液1 min，之后每間隔2 min 更換燒杯收集1 min，將收集液按順序進行編號1.2.3……。每個時段收集結束，立即測定每一個燒杯中透過液的體積、pH 和電導率，同時再將每個燒杯中的透過液混勻以觀察顏色。物料罐中的膜上截留液回流至物料罐混合均勻后立即測定pH 和電導率，測定后立即倒回物料罐混勻，每2 min 循環一次。循環操作直至物料罐中樣品達到物料罐最小容納體積量（200 mL）時關泵。

利用pH 計和電導率儀直接測量各溶液的pH 和電導率，使用前分別在室溫下進行儀器校正。

1.3.2 料液蛋白質含量分析

采用凱式定氮法，對脫脂乳、截留液和滲透液中的總氮、非蛋白氮和非酪蛋白氮含量進行測定。總氮含量參照文獻[16]測定，此方法測定的值包括蛋白氮和非蛋白氮；按照GB/T21704—2008《乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定》方法測定非蛋白氮含量[17]；按照王宜生[18]方法對非酪蛋白氮含量進行測定。按式（1）～（4）計算各蛋白含量：

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）蛋白質鑒定與分析

利用凝膠電泳測定各個階段的截留液和透過液中蛋白質類型及大致含量。分離膠的質量分數為12.5%，將截留液（稀釋10 倍）、透過液和脫脂乳（稀釋5 倍），按照1∶1 的比例加入2×SDS 裂解液，搖勻后于恒溫器95 ℃加熱1 min，離心后取10 μL 點樣，電泳結束后用考馬斯亮藍對凝膠進行染色，脫色至膠背景透明用凝膠成像儀進行拍攝。

1.3.4 膜通量、濃縮倍數與脫除率的計算、膜的污染與清洗

膜通量的計算公式：

式中：F為膜通量，L/(m2·h)；V為滲透液的體積，L；J為膜面積，m2；t為過濾時間，h。

濃縮倍數的計算公式：

式中：M為脫脂羊乳的質量，kg；m為過濾過程中某個時間滲透液的質量，kg。

膜對乳清蛋白脫除率的計算公式：

式中：M1為滲透液中乳清蛋白的質量，g；M2為脫脂乳中乳清蛋白的質量，g。

膜對酪蛋白脫除率的計算公式：

式中：M1為截留液中酪蛋白的質量，g；M2為脫脂乳中酪蛋白的質量，g。

純水通量衰減系數（WFD），可衡量膜的污染程度，值越大表示膜污染程度越高。

式中：J0和Jt分別為膜過濾前及過濾后只用水清洗一次后的純水通量，L·m-2·h-1。

純水通量恢復系數（WFR），用于衡量膜的清洗效果。

式中：JQ和J0分別表示膜過濾前和清洗后的純水通量，L·m-2·h-1。

1.4 數據處理

各實驗均重復進行3 次，結果表示為±s。利用SPSS 18.5 和Origin Pro 9.1 軟件對實驗數據進行統計處理與繪圖分析。采用方差分析法進行差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果對比

2.1.1 不同孔徑中空纖維膜所得透過液外觀比較

為了充分對比3 種孔徑中空纖維膜對脫脂乳中乳蛋白的分離效果，試驗過程中對這幾種膜所得滲透液進行了外觀對比。由圖2 可知，100、300 ku 和750 ku中空纖維膜滲透液分別呈清澈透明的黃綠色、輕微白色混濁和嚴重白色混濁，滲透液呈現黃綠色是含有VB 的緣故，ZULEWSKA J 等[19]研究發現透過液中的白色渾濁是由于部分酪蛋白發生滲透所造成的。

圖2 不同孔徑中空纖維膜所得透過液外觀

2.1.2 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果定性分析

由圖3 可以看出，100、300、750 ku 這3 種孔徑的中空纖維膜對酪蛋白和乳清蛋白的分離效果是不同的，其中100 ku 的膜在過濾后酪蛋白和乳清蛋白均被截留，透過液中不含乳清蛋白，表明該孔徑并沒有將其分離，只是進行了濃縮；300 ku 的膜在過濾后可以看出有少量的乳清蛋白存在于透過液中，同時截留液中依然存在部分乳清蛋白，表明酪蛋白和乳清蛋白并未完全分開；750 ku 的膜可以將酪蛋白和乳清蛋白有效地分離，大部分的乳清蛋白均被透過，只有極少部分的乳清蛋白存于截留液中，表明該孔徑的膜過濾效果較好。綜上所述，750 ku 的中空纖維膜能夠有效地將酪蛋白和乳清蛋白分離。

圖3 中空纖維膜乳蛋白分離SDS-PAGE

2.1.3 不同孔徑中空纖維膜羊乳蛋白分離效果定量分析

由表2 可以看出，隨著中空纖維膜孔徑的增大，酪蛋白占真蛋白的比例在截留液中有所增加，在透過液中減小；清蛋白占真蛋白的比例在截留液中減小，在透過液中增加。結合蛋白質的電泳定性分析，實驗選擇750 ku 的中空纖維膜可以兼顧截留酪蛋白和有效濾除乳清蛋白。

表2 3 種中空纖維膜乳蛋白分離樣品的蛋白質含量

2.1.4 中空纖維膜截留液與透過液pH 和電導率的測定

由圖4（a）和（b）可知隨著時間的延長截留液的pH升高，透過液的pH 降低。這是由于在過濾中H+透過膜進到透過液中導致透過液pH 降低，截留液pH 增加。

圖4 中空纖維膜截留液與透過液pH、電導率隨過濾時間的動態變化

電導率能夠及時反映液體物料體系中電解質的多寡，是動態跟蹤膜過濾過程的良好指標。由圖4 的（c）和（d）可知，截留液的電導率隨時間逐漸降低，而透過液的電導率則增大。這是由于在過濾中Na+、K+、P3-等離子透過膜進到透過液中導致透過液電導率上升，截留液電導率下降。這與李啟明等[20]的研究結果一致，牛乳中的Na+、K+、Cl-等一價離子幾乎全部在乳清相中，呈可溶性狀態。

2.2 不同孔徑卷式有機膜羊乳蛋白分離效果對比

2.2.1 不同孔徑卷式有機膜所得透過液外觀比較

為了充分對比2 種孔徑卷式有機膜對脫脂乳中乳蛋白的分離效果，試驗過程中對這幾種膜所得滲透液進行了外觀對比。由圖5 可知，0.1 μm 和0.45 μm 卷式有機膜滲透液呈清澈透明的黃綠色和輕微白色混濁的黃綠色，這說明0.45 μm 膜過濾時有酪蛋白透過。

圖5 不同孔徑卷式有機膜所得透過液外觀

2.2.2 不同孔徑卷式有機膜羊乳蛋白分離效果定性分析

由圖6 所示，脫脂乳在0.1 μm 的卷式有機膜過濾后酪蛋白幾乎全部被截留，同時大部分的乳清蛋白均被透過；0.45 μm 的膜過濾后，有一部分的酪蛋白進到了透過液中，表明該孔徑的膜偏大。綜上所述，0.1 μm 孔徑的卷式有機膜能夠有效的將酪蛋白和乳清蛋白分離。

圖6 卷式有機膜乳蛋白分離SDS-PAGE

2.2.3 不同孔徑卷式有機膜羊乳蛋白分離效果定性分析

由表3 可知，當卷式有機膜的孔徑增大時，截留液中酪蛋白占真蛋白的比例增加，乳清蛋白占真蛋白的比例減小；透過液中酪蛋白占真蛋白的比例明顯增加，乳清蛋白占真蛋白的比例明顯減少。結果表明，0.1 μm 的膜可以有效截留酪蛋白并濾除乳清蛋白。

表3 2 種卷式有機膜乳蛋白分離樣品的蛋白質含量

2.2.4 卷式有機膜截留液與透過液pH 和電導率的測定

如圖7（a）和（b）所示，隨著過濾時間的延長，截留液的pH 逐漸上升，透過液的pH 逐漸下降。截留液pH 在5.8～7.4 之間，透過液pH 在6.2～6.6 之間，變化趨勢較小，這是由于分離過程中離子變化導致的。

圖7 卷式有機膜截留液與透過液pH、電導率隨過濾時間的動態變化

如圖7（c）和（d）所示，截留液與透過液的電導率呈現相反的趨勢，隨著分離時間的延長，截留液電導率逐漸降低，透過液電導率逐漸增加，截留液電導率在6.16～6.32 間進行波動，透過液電導率在6.25～6.50間波動，兩者的變化浮動都比較緩慢，0.45 μm 膜分離的截留液與透過液均略高于0.1 μm。電導率變化趨勢與中空纖維膜一致。

2.3 膜通量的比較

由于酪蛋白和乳清蛋白直徑有很大差異，因此可以通過膜技術對其進行分離。膜過濾過程中，隨著時間的推移，截留液中固形物含量和料液黏度不斷增加，膜表面濃差化現象加劇且膜過濾的阻力增加，導致膜通量下降[21]。由圖8 可知，100、300、750 ku 的中空纖維膜初始膜通量分別為25.6、26.4、21.97 L/(m2·h)，使用后膜通量為9.2、10.1、10.9 L/(m2·h)；0.1 μm 和0.45 μm 的卷式有機膜初始膜通量為29.5 L/(m2·h) 和42.9 L/(m2·h)，使用后膜通量為20.1 L/(m2·h)和34.1 L/(m2·h)。卷式有機膜形成“二次膜”的速度小于中空纖維膜。由表2～3可知，750 ku 的中空纖維膜和0.1 μm 的卷式有機膜過濾效果較好。綜上所述，0.1 μm 的卷式有機膜即能有效地分離乳蛋白又能較慢的形成濾餅層。

圖8 中空纖維膜與卷式有機膜通量變化

2.4 膜的清洗與污染

在整個過濾過程中經過不斷的稀釋，濾餅層逐漸形成，中空纖維膜和卷式有機膜的膜通量由最初的142、435 L/(m2·h)降至51.5、262.5 L/(m2·h)，這是因為在膜表面形成了一層濾餅，增加了滲透液體的阻力，說明膜受到了一定程度的污染。稀釋過濾后對2 種膜分別進行了1 mol/L NaOH 清洗、pH=3 磷酸清洗和0.3 %次氯酸鈉與NaOH 混合清洗。污染與清洗情況如表4 所示，由表4 數據可知750 ku 中空纖維膜的純水通量衰減系數（63.7%）大于0.1 μm 的卷式有機膜的純水通量衰減系數（39.7%），說明在過濾過程中中空纖維膜的污染速度較快，污染程度較高。同時可以看出，以上的3 種清洗方法中，次氯酸鈉與NaOH 混合清洗后中空纖維膜的純水通量恢復系數為88.5%；卷式有機膜的純水通量恢復系數為97.1%，清洗效果優于其他2 種清洗方法，膜通量得到了很好的恢復。綜上所述，0.1 μm 的卷式有機膜用次氯酸鈉與NaOH 混合的方法清洗膜通量恢復效果最佳。

表4 不同階段純水通量變化

2.5 最佳膜分離效果比較

由表5 可知，750 ku 中空纖維膜過濾后，透過液中羊乳酪蛋白脫除率為98.8 %，截留液中乳清蛋白脫除率為82.7 %；0.1 μm 卷式有機膜過濾后透過液中羊乳酪蛋白脫除率為99.6 %，截留液中清蛋白脫除率為82.7 %。與徐殊等[22]采用100 nm 陶瓷膜所分離酪蛋白和乳清蛋白相比，分離效果更佳。膜法分離能夠有效的截留酪蛋白，可用于奶酪的生產。透過液中清蛋白/酪蛋白的比值都大概為11，比原料乳中的0.22 提高了50 倍，該乳清蛋白與酪蛋白的比例滿足嬰幼兒配方奶粉的應用要求。比較2 種膜分離過程中膜通量的變化來看，0.1 μm 卷式有機膜出現“二次膜”的速度較慢，污染程度更低，清洗后膜通量恢復率更大，表明其更易于清洗和恢復。與傳統的酶法和酸法提取酪蛋白相比，膜法所得的酪蛋白中不含殘留的凝乳酶、發酵劑、乳酸等，更加綠色環保，所以0.1 μm 卷式有機膜更適于工業化應用。

表5 最佳膜分離效果比較

3 結 論

將2 種不同材質的中空纖維膜（100、300、750 ku）與卷式有機膜（0.1 μm、0.45 μm）進行比較分析后發現，750 ku 中空纖維膜和0.1 μm 卷式有機膜既能將酪蛋白較好的截留，又能有效的將乳清蛋白透過，2 種孔徑膜通過實驗得到的平均膜通量值分別是25.7 和25.2 L/(m2·h)。比較膜的污染與清洗結果，0.1 μm 卷式有機膜純水通量衰減系數（39.7%）小于750 ku 中空纖維膜系數（63.7%），說明該卷式有機膜污染慢，污染程度低，通過3 種膜清洗方案比較，發現次氯酸鈉與NaOH 混合液清洗的效果最佳，使750 ku 中空纖維膜的水通量恢復系數達到88.5%，0.1 μm 卷式有機膜的純水通量恢復系數達到97.1%。綜上所述，0.1 μm 卷式有機膜是最適合分離乳蛋白的膜。