海洋細菌Pseudoalteromonas sp. 01中新型褐藻膠裂解酶AlyPC1的研究*

張紅秀, 劉曉華, 劉偉治

(中國海洋大學海洋生命學院 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003)

褐藻是海洋大型藻類中規模最大、形態最復雜的一類,褐藻膠(Alginate)是褐藻的基本碳水化合物成分[1]。褐藻綱中,尤其是在曾藻目和巖藻目中,一些海藻所含的褐藻膠量特別大,約占其干質量的55%[2]。褐藻膠是一種線性多糖,由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate,M)以及α-L-古羅糖醛酸(α-L-guluronate,G)構成,這2種差向異構體可以形成3種不同的嵌段(多聚甘露糖醛酸片段(polyM)、多聚古羅糖醛酸片段(polyG)以及交替雜合片段(polyMG))[3]。褐藻膠具有優異的凝膠性、穩定性以及增稠性,在食品、紡織、醫藥等領域有著廣泛的應用[4]。但是褐藻膠分子量大,難以被機體吸收利用,限制了其應用的廣泛程度。由于褐藻膠制備形成的褐藻寡糖(Alginate oligosaccharides,AOS)具有比褐藻膠分子量小、水溶性高以及黏度低的優勢,因此褐藻寡糖的應用范圍更廣[5]。褐藻寡糖具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、抗高血壓、抗腫瘤、抗凝血、免疫調節以及促進植物生長等活性[6-8]。

研究表明,同物理法以及化學法相比,酶解法(所用的酶主要是褐藻膠裂解酶)制備褐藻寡糖具有作用條件溫和、產率高的優勢,在褐藻寡糖產業化制備中具有重要的應用前景[9]。褐藻膠裂解酶(Alginate lyases)屬于多糖裂解酶家族(Polysaccharide lyases family,PL),主要是通過β-消除反應降解褐藻膠[10]。在碳水化合物酶的數據庫中(http://www.cazy.org/),根據一級序列,已發現的褐藻膠裂解酶被分成14個褐藻膠裂解酶家族,分別是PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39以及PL41[11]。越來越多的褐藻膠裂解酶被表征,但由于以往的褐藻膠裂解酶存在純化繁瑣、穩定性差以及酶活力低等問題,導致其極少應用于生產制備褐藻寡糖[12]。因此,仍需要不斷開發挖掘新型的褐藻膠裂解酶,應用于褐藻寡糖的大規模制備[13-14]。

本文從頰吻鼻魚腸道酶篩選到一株海洋細菌Pseudoalteromonassp. 01,從中克隆了一個PL7家族的褐藻膠裂解酶,該酶是雙功能的內切酶,能夠有效降解各種形式的褐藻膠,產生聚合度(Degrees of polymerization,DPs)為2～4的褐藻寡糖。酶學性質表明,該酶能夠在適中的反應溫度以及較寬的pH范圍發揮作用,具有開發成為工具酶的潛能。

1 儀器,材料與方法

1.1 菌株、試劑與儀器

菌株:E.coliBL21(DE3)、質粒pET32a-p以及Prescission蛋白酶均由本實驗室制備并保存;Pseudoalteromonassp. 01是從頰吻鼻魚腸道微生物中獲得,并由實驗室保存。

試劑:褐藻膠購自上海源葉生物有限公司;通過酸解法制備而獲得polyM和polyG[15]; Ni-NTA瓊脂糖凝膠購自于康為世紀生物科技有限公司;所使用的限制性內切酶是BamH Ⅰ和XhoⅠ,所使用的T4 DNA連接酶以及PrimerSTAR?HS DNA聚合酶均購自于Omega Bio-Tek公司;其他化學試劑均購自于國藥集團。

儀器:T100 PCR儀(供應商:美國Bio-RAD);電泳儀(供應商:北京六一儀器廠);垂直蛋白電泳裝置(供應商:美國BIO-RAD);細胞超聲破碎儀(供應商:寧波新芝生物科技有限公司);酶標儀(供應商:美國Bio-Tek)。

1.2 實驗方法

1.2.1 AlyPC1序列分析 基于微生物培養法,從頰吻鼻魚腸道微生物中篩選到一株高效降解褐藻膠的菌株Pseudoalteromonassp. 01,推測其基因組中含有降解褐藻膠的相關酶系。對其基因組進行測序,從注釋的信息中獲得了一個褐藻膠裂解酶的基因,將該酶命名為AlyPC1。

首先,使用在線軟件SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測AlyPC1的信號肽,使用在線軟件SMART(http://smart.embl.de)[16]預測分析AlyPC1的結構域,利用MEGA 7.0中最大擬然法,將AlyPC1的氨基酸序列同PL7家族各成員的氨基酸序列進行比對分析,構建系統發育樹。利用Bioedit軟件對AlyPC1和同亞家族的序列進行多序列比對,然后利用在線軟件ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)對多序列比對結果進行分析。通過在線軟件Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)預測AlyPC1的分子量。

1.2.2 AlyPC1原核表達載體的構建 以Pseudoalteromonassp. 01基因組DNA為模板,設計PCR正向引物PC1-F(CGCGGATCCTGTGGCTCATCATCACCAACTAATG)和反向引物PC1-R(CCGCTCG-AGTTAATTATGTGAAGTAAATAAGCGATAG),獲得了不含信號肽的alypc1片段。引物PC1-F和PC1-R分別含有BamHⅠ的酶切位點和XhoⅠ的酶切位點,利用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ將PCR片段酶切;同時利用上述限制性內切酶將質粒pET32a-p線性化。將酶切片段與質粒pET32a-p通過T4 DNA連接酶連接;連接產物轉化入E.coliBL21(DE3)中,獲得的陽性克隆,送至上海生工生物有限公司進行測序,并將其中測序正確的克隆被命名為pET32a-AlyPC1。

將保存的甘油菌pET32a-AlyPC1按照1%的比例接種于含有氨芐霉素(Amp)抗性的50 mL 溶菌肉湯(LB)液體培養基中,在37 ℃條件下180 r/min搖床培養12 h;活化的菌株按照1%的接種量接種于含有1 L LB液體培養基的錐形瓶中,培養基中加入Amp,在37 ℃條件下培養,待OD600值在0.6～0.8之間時,向培養基中加入終濃度為0.1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),16 ℃ 180 r/min培養20 h。

培養結束后收集菌體,然后使用15 mL的緩沖液(Tris-HCl(pH=7.5)20 mmol/L、NaCl 500 mmol/L和咪唑10 mmol/L)重懸菌體,使用超聲破碎儀破碎菌體(程序為超聲2 s后暫停4 s,總循環時間為25 min);超聲破碎結束后,12 000g離心30 min,收集上清液。上清液通過鎳離子金屬鰲合親和層析介質(Ni-NTA)瓊脂糖凝膠親和層析純化后,用蛋白酶酶切,以除去融合蛋白中硫氧還蛋白(TRX)標簽,獲得目的蛋白AlyPC1。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析蛋白純度,使用酶標儀檢測OD280值,測定蛋白濃度。

1.2.3 酶活力性測定 將褐藻膠底物溶解于含Tris-HCl(pH=8.0)20 mmol/L + NaCl 200 mmol/L 的緩沖液中,配制成濃度為2 mg/mL褐藻膠溶液。反應體系有200 μL,其中包括190 μL底物溶液(2 mg/mL)以及10 μL 0.06 mg/mL的AlyPC1,在35 ℃條件下反應5 min,反應結束后在100 ℃滅活10 min。由于降解產生的褐藻寡糖含有不飽和雙鍵,在波長235 nm處有高吸收值,因此,取200 μL反應產物檢測OD235值。以190 μL 褐藻膠以及10 μL的緩沖液(Tris-HCl(pH=8.0)20 mmol/L + NaCl 200 mmol/L)的反應作為對照組。酶活力單位(U)定義為每分鐘OD235增加1為1 U[17]。

1.2.4 AlyPC1酶學性質表征 為確定AlyPC1的最適反應溫度,在5～60 ℃下進行酶活測定;為測定熱穩定性,將酶在5～60 ℃條件下孵育1 h后,測定其剩余活性。為了研究AlyPC1的最適反應pH,將底物溶解于濃度為20 mmol/L的不同pH的緩沖液中,其中緩沖液有CH3COONa溶液(pH在 5.0～6.0之間)、Na2HPO4-NaH2PO4溶液(pH在 6.0～7.5之間)、Tris-HCl溶液(pH在7.5～9.0之間)和Gly-NaOH溶液(pH在 9.0～11.0之間)4種,并在最適反應溫度下測定酶活。為了確定NaCl含量對AlyPC1酶活性的影響,向反應底物中添加不同比例的NaCl,NaCl含量梯度設定為0、50、100、200、300、400、500和600 mmol/L。為測定不同金屬離子和EDTA對AlyPC1的影響,將反應體系分成10組,每組中分別添加 1 mmol/L的 K+、Na+、Cu2+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+和EDTA,以不添加任何金屬離子測定的酶活性為對照,測定AlyPC1的酶活。為測定底物專一性,將褐藻膠、polyG和polyM作為底物,分別溶解于三個20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)+200 mmol/L NaCl緩沖液中,在最適反應條件下測定酶的底物專一性。

1.2.5 AlyPC1對褐藻膠的降解過程 將2 mg/mL褐藻膠溶解于20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)+200 mmol/L NaCl緩沖液中,取100 μL褐藻膠同3 U的AlyPC1反應,分別在降解0、1、5、10、20、30和60 min時取樣,最后利用薄層色譜(Thin layer chromatography,TLC)分析不同降解時間下褐藻膠降解的產物分布。

2 實驗結果

2.1 AlyPC1序列分析

從Pseudoalteromonassp. 01中克隆出一種褐藻膠裂解酶基因alypc1,GeneBank收錄號為ON112080。該酶的cDNA共計1 737 bp,編碼578個氨基酸殘基,去掉信號肽后,AlyPC1的理論分子量為61 kDa。經在線軟件SignalP 5.0預測出AlyPC1的前22個氨基酸殘基(Met1-Gly22)為信號肽。如圖1所示,AlyPC1是一個多結構域褐藻膠裂解酶,有2個非催化結構域以及一個催化結構域構成,其中2個非催化結構域分別為CBM32和CBM6。系統發育樹(見圖2A)表明,AlyPC1屬于PL7家族第5亞家族。同時,多序列比對(見圖2B)表明,AlyPC1的催化結構域AlyPCCD的氨基酸序列同來源于Microbulbifersp. 6532A的AlyMsp[18]的氨基酸序列相似性最高,約為65.2%。

圖1 AlyPC1結構域示意圖

(A:AlyPC1系統進化樹;B:AlyPC1的催化結構域AlyPCCD與PL7褐藻膠裂解酶一級序列比對。圖B中所有序列的來源信息同圖A中的一致。A:The phylogenetic tree of AlyPC1; B: Multiple amino acid sequence alignment of AlyPC1 and other alginate lyases of PL7 sub.5. The source information for all sequences in Figure B is consistent with that in Figure A.)

2.2 AlyPC1蛋白純化

將克隆的alypc1片段與pET32a-p載體質粒連接后轉化至E.coliBL21(DE3)中,融合蛋白在16 ℃誘導表達20 h。如圖3第2、3泳道所示,融合蛋白AlyPC1能夠正確表達,且為可溶性蛋白。SDS-PAGE電泳結果如圖3第4泳道所示,可通過Ni-NTA瓊脂糖凝膠純化并用Prescission蛋白酶酶切后可以獲得純度較高的AlyPC1,分子量為61 kDa,同預測分子量相近。經計算,1 L菌體培養液可獲得20 mg純化蛋白。

(M:蛋白標準品;1:未誘導菌體;2:IPTG誘導后菌體;3:菌體超聲破碎后上清液;4:經純化-蛋白酶酶切后的目的蛋白AlyPC1。M: Protein marker; 1: The bacterium before induction; 2: The bacterium after induction by IPTG; 3. The supernatant after sonication; 4. The protein AlyPC1 after purification and Prescission digestion.)

2.3 AlyPC1酶學性質表征

如圖4A所示: AlyPC1最適反應溫度為35 ℃,在5 ℃時其酶活性僅為其最高酶活性的60%;高于40 ℃時其酶活性迅速下降;在60 ℃時其酶活性僅為其最高活性的20%。將AlyPC1置于5～60 ℃孵育1 h,通過測定剩余活性驗證AlyPC1的穩定性(見圖4B),AlyPC1在低于30 ℃條件下孵育后,酶活性保留了約80%,但是隨溫度升高,孵育后剩余活性降低,在40 ℃孵育后活性僅剩30%左右。如圖4C所示,AlyPC1最適反應pH為8.0,且pH在7.5～9.0之間時其酶活性保留90%以上。綜上所述,AlyPC1在適中溫度以及較為寬泛的pH范圍內發揮作用,具有開發成為工具酶的潛能。

(A:溫度對AlyPC1活性的影響;B:AlyPC1溫度穩定性;C:pH對AlyPC1活性的影響;D:NaCl濃度對AlyPC1活性的影響;E:金屬離子對AlyPC1活性的影響;F:AlyPC1底物特異性。A: The effect of temperature on the enzymatic activity of AlyPC1; B: The thermal stability of AlyPC1; C: The effect of pH on the enzymatic activity AlyPC1; D: The effect of NaCl concentration on the activity of AlyPC1; E: Effects of metal ions on the activity of AlyPC1; F: Substrate specificity of AlyPC1.)

NaCl含量對AlyPC1活性的影響如圖4D所示,反應體系含有NaCl 200 mmol/L時的酶活最高;反應體系中不添加NaCl時的酶活性僅為反應體系中含有NaCl 200 mmol/L時的酶活性的60%。同時,本研究中測定了不同金屬離子對于AlyPCL酶活性的影響(見圖4E),K+、Na+、Ca2+和Mg2+對于AlyPC1的酶活性有輕微的促進作用。相反,Mn2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+以及EDTA能夠明顯抑制AlyPC1的酶活性。

此外,如圖4F所示,AlyPC1能夠有效地降解褐藻膠、polyG以及polyM三種底物,比活力分別為425.4、298.6和 152.5 U/mg,表明AlyPC1為雙功能褐藻膠裂解酶[8]。

2.4 AlyPC1對褐藻膠的降解過程

AlyPCl降解褐藻膠如圖5所示:前30 min內,AlyPCl隨機切斷褐藻膠,從而產生聚合度較高的褐藻寡糖,此時產生的寡糖以四糖為主,表明AlyPC1是一個內切型褐藻膠裂解酶;30 min后,小分子量的褐藻寡糖降解后的主要產物為三糖,最終的反應產物中含有二糖、三糖以及四糖。

圖5 TLC檢測AlyPC1降解褐藻膠隨時間變化的產物

3 討論

AlyPC1最適反應溫度為35 ℃,在低于30 ℃條件下可以穩定存在1 h,說明AlyPC1在較為適中的溫度下發揮作用。PL6家族的TsAly6A最適反應溫度為35 ℃,但是在10和20 ℃下的酶活性分別是最大活性的21.1%和73.1%[19];而相同條件下,AlyPC1的酶活性分別是最高活性的64.4%和82.2%,這說明AlyPC1在室溫下更具有優勢,有利于降低制備寡糖的成本。另外,來自于同家族的rPyAly[20]和AlyD[21]最適反應pH均為8.0,但是在pH=7.5以及pH=9.0時,rPyAly[20]和AlyD[21]的酶活性分別是其最大活性的80%和60%[21];而相同反應條件下,AlyPC1能夠保留其最高活性的90%以上,表明AlyPC1能夠在較為寬泛的pH范圍內發揮作用,降低了反應過程對緩沖液pH的需求。

AlyPC1可以降解褐藻膠、polyG以及polyM,但降解效率不同,證明AlyPC1是一個有偏好性的雙功能的褐藻膠裂解酶。各種形式的褐藻膠均可作為AlyPC1的底物,說明AlyPC1可以充分利用資源。