基于LC-MS代謝組學技術的麗豆-大豆差異代謝物比較研究

胡 悅, 任保青, 陳陸琴, 曹建庭, 劉兵兵*

(1. 山西大學黃土高原研究所, 太原 030006; 2. 太原植物園, 太原 030021 )

麗豆(Calophacasinica) 是一種多年生直立灌木,為蟲媒異花授粉型植物,隸屬于豆科蝶形花亞科麗豆屬 (CalophacaFisch. ex DC.)。該屬約10個種,有3個種分布在中國,分別是麗豆 (C.sinica)、華麗豆 (C.chinensis) 和新疆麗豆 (C.soongorica) (李建平和陳思,2019)。其中,麗豆僅分布在內蒙古陰山山脈以南和山西中南部地區,目前其分布范圍仍在不斷縮小,其個體數量也在不斷變少(馬倩,2012),已成為華北地區特有的一種珍稀易危植物(中國科學院中國植物志委員會,1993)。李建平和陳思(2019)研究表明,麗豆種子營養價值較高,富含蛋白質、碳水化合物、糖類等人體不可或缺的營養物質,極具開發潛力。此外,麗豆具有耐寒、耐旱、耐土壤貧瘠的特性,能在較為嚴峻的環境中生存且能為水土保持做出一定貢獻(武紅柱等,2017)。然而,我們對這樣一種兼具經濟和生態雙重價值,且處于易危狀態的植物卻缺乏足夠的了解,尤其是利用代謝組學方法對其種子代謝組化學成分的解析鮮有報道。

植物代謝組學是一門新興的交叉學科(郭鳳丹等,2017),是系統生物學的主要分支之一(曾超珍等,2017)。它可對提取物中參與生物體新陳代謝且相對分子量不足1 000的內源性小分子進行無差別的整體性代謝成分分析(張傳義,2018)。代謝組學的研究方法經歷了質譜(mass spectrometry, MS)(Verdonk et al.,2003)、高效液相色譜(high-performance liquid chromatog-raphy, HPLC)(林艷萍等,2007)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)等技術,目前最新的方法是基于液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)的代謝組學技術,此技術可以找到相似物種成分之間的變化趨勢,從整體上研究其代謝產物的差異,目前已在植物學(段禮新和漆小泉,2015)、微生物學、醫學(Tamas et al.,2011)等各個領域得到了廣泛的應用。比如,Rafael等(2019)通過LC-MS代謝組學方法分析了鷹嘴豆(Cicerarietinum)、扁豆(Lensculinaris)和白豆(Phaseolusvulgaris)之間的代謝物差異,結果從43種差異代謝物中鑒定到了3個種間的判別性化合物;Gong等(2020)通過比較代謝組學分析了3個水稻品種食用品質的內在機制,從而揭開了3個品種間口感和風味差異的核心因素;高淑芳等(2022)利用LC-MS技術表征了刀鱭卵巢內400多種化學成分,并通過比較代謝組學方法鑒定出海水刀鱭和淡水刀鱭之間的47種差異代謝物,揭示了二者在卵巢發育上的分化;武紹龍等(2022)采用LC-MS技術鑒定出馬纓杜鵑在不同時期的973種代謝物,揭示了馬纓杜鵑花從開花至凋謝過程中代謝產物的變化情況;姜武等(2021)對不同種質多花黃精的化學成分進行LC-MS檢測,從紅桿和綠桿多花黃精樣品中共篩選出22種代謝產物,其中在紅桿多花黃精中表達量高于綠桿多花黃精的差異代謝物就有15種,此結果可為多花黃精優良品種的選用提供一定的理論支持;Yuan等(2021)探究了西瓜野生種和栽培種間的差異代謝物,共鑒定出431種差異代謝物,為基于代謝組學的西瓜果實改良提供了數據基礎,促進了其營養特性的增強或種質的升級。由此可見,基于LC-MS技術的代謝組研究為我們解析不同植物的代謝物差異和營養價值比較提供了一種高效的方法。

麗豆作為我國華北地區特有的一種珍稀野生植物資源(謝勇等,2018),亟須我們全面了解麗豆的代謝組成分,以評估其營養價值,從而為我們對麗豆資源的深度開發和高效利用提供科學依據。大豆(Glycinemax)是麗豆的近緣種,它們同屬于豆科蝶形花亞科,也是人們日常植物蛋白最重要的來源之一(武林琳,2022),其所含有的多種生物活性成分對預防各種心腦血管疾病、糖尿病和癌癥起到一定的作用(Kumar et al., 2013)。因此,本研究選擇大豆為對照樣品,采用基于LC-MS技術的比較代謝組方法對麗豆和大豆的代謝產物進行比較,并通過KEGG數據庫開展代謝通路富集分析,解析其功能和作用,以期深入評估麗豆的營養價值和應用前景。本研究結果將為我們對麗豆資源的開發利用,以及為將來全面揭示麗豆代謝組組成提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

在本研究中,大豆是生活超市中最常見的黃大豆,而麗豆采自其原生境之一的山西省太原市天龍山自然保護區的山坡灌木叢中(112° 25′ 10.56″ E、37° 43′ 22.44″ N),海拔1 180 m。天龍山自然保護區地處黃土高原及華北平原交界抬升區,海拔落差大,氣候分區豐富,屬暖溫帶大陸性季風氣候,受季風影響,夏秋多雨并集中,冬春干旱多西北風,多年平均降水量為487 mm(郭艷萍和李洪建,2022),年內降水分配不均,主要集中于7—9月;保護區內植物資源較為豐富,植被覆蓋度高,且相對穩定,具有典型的北溫帶性質(郭秋霞, 2021)。按照生態學調查采樣方法我們采集了50株麗豆的種子(圖1),種子帶回實驗室后,每株隨機選取3～5粒飽滿的種子制成1份混合樣品用于后續的代謝組分析。

圖1 麗豆植株(a)及種子(b)照片Fig. 1 Photos of plant (a) and seeds (b) of Calophaca sinica

1.2 代謝物提取

主要處理流程如下:(1)取大豆和麗豆種子各10 g(大約100粒),研磨儀充分打碎、研磨至粉狀待用;(2)在1.5 mL EP管中加入100 μL(約100 mg)步驟(1)中的樣本,再加入300 μL甲醇和20 μL內標,渦旋混勻30 s;(3)冰水浴超聲10 min;(4)零下20 ℃ 靜置1 h;(5)在4 ℃,13 000 r·min-1條件下將樣本離心15 min;(6)小心取200 μL上清液加入2 mL進樣瓶中,再取200 μL QC (quality control) 樣本上機檢測。

1.3 上機檢測

由沃特世Acquity I-Class PLUS超高效液相串聯沃特世Xevo G2-XS QTof高分辨質譜儀組成用于代謝組學分析的液質聯用系統,所使用色譜柱為購自沃特世的Acquity UPLC HSS T3 色譜柱(1.8 μm, 2.1 mm × 100 mm)。

正離子模式:流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為0.1%甲酸乙腈。負離子模式:流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為0.1%甲酸乙腈。進樣體積為1 μL。

1.4 代謝物定量

對MassLynx V4.2采集的原始數據使用Progenesis QI軟件做峰提取、峰對齊等數據處理操作,基于Progenesis QI軟件在線METLIN數據庫及北京百邁客生物科技有限公司自建庫進行鑒定,同時進行理論碎片識別。分析前先對數據進行歸一化處理,采取的方式是總峰面積歸一化即每個樣本的每個代謝物除以該樣本總的峰面積。

1.5 KEGG分析

將所有鑒定到的代謝物整理成*.txt文件,上傳至KEGG 數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/)代謝物通路進行注釋分析,在注釋結果中,選取KO pathway level2條目注釋最多的Top20注釋信息繪圖。

2 結果與分析

2.1 麗豆與大豆代謝組成分分析

麗豆和大豆中共檢測到1 857種代謝組成分,分屬于68個種類(圖2)。其中,其他類的化學成分最多,有1 271種;在剩余的586種代謝組成分中,種類最多的前6位分別為羧酸及其衍生物(即氨基酸類)(135種)、脂肪酰基(68種)、丙烯醇脂質(43種)、有機氧化合物(40種)、類固醇及其衍生物(34種)以及甘油磷脂(28種)。這一結果表明麗豆和大豆一樣,含有豐富多樣的氨基酸類化合物,具有很好的營養價值。

圖2 麗豆與大豆代謝組成分類別統計Fig. 2 Categorical statistics of metabolic components of Calophaca sinica and Glycine max

2.2 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

麗豆與大豆的差異代謝物主要分布在20條代謝途徑中,其中P<0.1的代謝途徑有8條,分別是二萜類生物合成,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解,青霉素和頭孢菌素生物合成,肌醇磷酸代謝,糖基磷脂酰肌醇錨定生物合成,生物合成自噬,賴氨酸生物合成,氨基酸的生物合成(圖3:a)。

a. 橫軸為注釋到該通路的差異代謝物數目,縱軸為通路名稱; b. 橫軸表示該通路中的差異代謝物與有通路注釋的所有差異代謝物的比值。1. 二萜類生物合成; 2. 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解; 3. 青霉素和頭孢菌素生物合成; 4. 肌醇磷酸鹽代謝; 5. 糖基磷脂酰肌醇(GPI)—錨; 6. 生物合成自噬—其他; 7. 賴氨酸生物合成; 8. 氨基酸的生物合成; 9. 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成; 10. 各種次級代謝產物的生物合成—第2部分; 11. 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成; 12. 磷酸鹽和次磷酸鹽代謝; 13. 核黃素代謝; 14. 磷脂酰肌醇信號系統; 15. 嘌呤代謝; 16. 甘油磷脂代謝; 17. 糖酵解/葡萄糖生成; 18. 吲哚生物堿生物合成; 19. 葡萄糖苷酸生物合成; 20. 花生四烯酸代謝。a. The horizontal axis is the number of differential metabolites annotated to the pathway, and the vertical axis is the name of the pathway; b. The horizontal axis represents the ratio of the differential metabolite in this pathway to all the differential metabolites with pathway annotation. 1. Diterpenoid biosynthesis; 2. Valine, leucine and isoleucine degradation; 3. Penicillin and cephalosporin biosynthesis; 4. Inositol phosphate metabolism; 5. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor; 6. Biosynthesis autophagy-other; 7. Lysine biosynthesis; 8. Biosynthesis of amino acids; 9. Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis; 10. Biosynthesis of various secondary metabolites-Part 2; 11. Valine, leucine and isoleucine biosynthesis; 12. Phosphonate and phosphinate metabolism; 13. Riboflavin metabolism; 14. Phosphatidylinositol signaling system; 15. Purine metabolism; 16. Glycerophospholipid metabolism; 17. Glycolysis/Gluconeogenesis; 18. Indole alkaloid biosynthesis; 19. Glucosinolate biosynthesis; 20. Arachidonic acid metabolism.圖3 差異代謝物通路分類圖 (a)和KEGG富集圖 (b)Fig. 3 Differential metabolites pathway classification map (a) and KEGG enrichment map (b)

初級代謝產物富集量最多的通路是氨基酸的生物合成(圖3:b),分別為L-纈氨酸↓、L-酵母氨酸↓、苯丙醇胺↓、高檸檬酸↓;賴氨酸生物合成,分別為L-酵母氨酸↓和高檸檬酸↓;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,分別為奎尼酸↑和吡哌酸↓。次級代謝產物富集量最多的通路是各類次生代謝生物合成,分別為羅漢松脂素↑和吡哌酸↓;嘌呤代謝,分別為吲哚-3-甲醛↑和鳥嘌呤核苷↓;甘油磷脂代謝,分別為磷脂酰肌醇↓和溶血磷脂酰膽堿[18∶3(6Z,9Z,12Z)]↓;花生四烯酸代謝,分別為Δ12-前列腺素J2↑和15-脫氧-Δ-12,14-前列腺素J2↓;二萜類生物合成,分別為巴卡丁Ⅲ↑和對映-貝殼杉-16-烯-19-酸↓。綜上可見,麗豆和大豆的初生代謝產物差異主要集中在各類氨基酸的生物合成上,且整體表現為下調;次生代謝產物的差異主要集中在羅漢松脂素,花生四烯酸以及二萜類生物合成上,且主要表現為上調。

2.3 麗豆與大豆差異代謝物分析

通過對麗豆和大豆的代謝組成分的種類和含量進行兩兩比較,共檢測出159種差異代謝物(表1)。其中,大約30%(48種)的差異代謝物在麗豆中含量高于大豆,且有5種為麗豆中特有成分;剩余約70%(111種)的差異代謝物在麗豆中的含量低于大豆,且有4種在麗豆中未被檢出,是大豆的特有成分。由上述結果可見,在代謝物成分的含量上,二者的差異不足10%,即麗豆中超過90%的代謝物在含量上與大豆相似,表明麗豆與大豆一樣,具有很高的營養價值;在差異代謝物成分的種類(159種)組成上,麗豆雖然比大豆少4種,但是它比大豆多了5種獨有的成分,這表明與大豆相比,麗豆有其獨特的營養價值。

表1 麗豆和大豆的差異代謝物Table 1 Differential metabolites of Calophaca sinica and Glycine max

在159種差異代謝物中,麗豆比大豆含量高的化學組分共有43種,其具體的相對含量詳見表2。由表2可知,僅有不到10種化學組分屬于初級代謝物,如屬于氨基酸類代謝過程中的L-苯丙氨酸-L-脯氨酸和絲氨酸-組氨酸,糖類代謝過程中的Gypsogenin 3-O-鼠李糖基葡糖醛酸,28- [葡糖基-(1->6)-葡糖基]齊墩果酸3-阿拉伯糖苷,以及β-檸檬酸等。其中,麗豆中L-苯丙氨酸-L-脯氨酸的含量遠高于大豆,大約是大豆的40倍;麗豆中β-檸檬酸的含量是大豆的10倍。剩余超過75%的化學組分均為次生代謝物,比如,麗豆在脂肪酰基、苯及其取代衍生物以及其他類化學組分中,有12種化學組分的含量超過大豆10倍之余,它們分別是△12-前列腺素J2、奎尼酸、阿莫曲坦、N-甲基酪胺、氨芐西林、乙磺酰亞胺、4-羥基苯甲酸甲酯、脫落酸、阿魏酸等。此外,與大豆相比,麗豆中還存在5種特有的化學組分,它們分別是3-胍基丙酸、巴卡丁Ⅲ、羅漢松脂素、無效苷和脫乙酰乙烯多林,也都屬于次生代謝物。這一結果表明,麗豆比大豆含量高的化學組分主要集中在次生代謝物方面,而在初生代謝物中,僅L-苯丙氨酸-L-脯氨酸具有明顯的優勢。

3 討論與展望

代謝產物是生物體代謝過程中產生或消耗的有機化合物,它的組成種類和含量決定著植物的營養價值(李靜等,2017)。本研究對麗豆和大豆的比較代謝組研究結果表明,在二者中共檢測到1 857種代謝產物,而麗豆中超過90%的代謝產物與大豆不僅在成分上相似,含量上也相近,這一結果可能與二者是近緣種有關,同時也表明麗豆與大豆一樣,具有很高的營養價值,具備成為我們未來生活中植物蛋白第二來源的潛力。

在對二者的差異代謝物分析中,我們共檢測到159種化學組分,其中有48種(約30%)在麗豆中的含量高于大豆。KEGG注釋結果表明,這48種化學組分主要是一些次生代謝物,且大多集中在羅漢松脂素,花生四烯酸以及二萜類生物合成上。比如,△12-前列腺素J2(△12-prostaglandin J2,△12-PGJ2),它在麗豆中的含量是大豆中的107倍,有研究表明利用△12-前列腺素J2形成的以聚乳酸-乙醇酸共聚物為載體的納米粒(△12-PGJ2-NC)可以使某些骨壞損區的基因和蛋白表達水平上調,可應用于牙周病的治療,并且在骨壞損的修復方面具有很好的應用潛力和開發價值(Chen et al.,2015);奎尼酸在麗豆中的含量是大豆中的68倍,它可以抑制血小板的凝集,對腦血栓的形成具有一定抑制效應,在體內還可以轉化為特殊物質,對病毒和癌細胞產生抑制作用,可用于抗病毒和抗癌藥物的制備,此外奎尼酸還具有抑制疼痛和減輕炎癥的效果(周萌,2013);阿莫曲坦在麗豆中的含量是大豆中的40倍,它是抗偏頭痛藥物中的有效成分,可用于治療常見的急性偏頭痛發作,且具有很高的血管選擇性,耐受性比較好,已被廣泛應用(王鵬等,2016);N-甲基酪胺,在麗豆中的含量是大豆中的31倍,可用于治療休克(嚴幼芳等,1983; 戴漢云和熊正東,1989)。氨芐西林(ampicillin),別名氨芐青霉素,在麗豆中的含量是大豆中的13倍,它是一種可以抑制體內致病菌的抗生素,通常用于治療多種細菌感染疾病如呼吸道、腸道細菌感染、腦膜炎以及感染性心內膜炎等(楊茜等,2022)。乙磺酰亞胺又稱乙琥胺,在麗豆中的含量是大豆中的12倍,可用于治療老年性耳聾(蘇毅鵬,2014)和兒童失神性癲癇(范磊和陳海燕,2013)。4-羥基苯甲酸甲酯和脫落酸,在麗豆中的含量是大豆中的11倍,前者能延緩與年齡相關的生理過程的衰退(Mi et al., 2018),后者可以抑制多種癌細胞的增殖,還可以促進間質干細胞的增大和定向造血干細胞的生長,是多種疾病治療的潛在藥物(郭天藝,2017)。阿魏酸在麗豆中的含量超過大豆10倍,有研究表明,阿魏酸可以抑制炎癥反應,達到治療動脈粥樣硬化的目的(楊琳潔等,2021)。

除了上述化學組分外,本研究還發現了一些麗豆特有的化學組分。比如,β-胍基丙酸,它對于調節血糖水平、改善高血糖癥具有一定的療效,且β-胍基丙酸是一種可以溶于水的結晶粉末,因此糖尿病患者有時會將其加入食物中作為補充劑(Baumgarner et al.,2015)。巴卡丁Ⅲ是麗豆中的又一特有組分,它是紫杉酚的前體,它可以顯著促進機體產生更強的免疫球蛋白,還可誘導機體產生Th1和Th2型免疫反應,是一種理想的待開發疫苗佐劑(袁林等,2014)。此外,還有羅漢松脂素,又稱馬泰瑞松醇,它是一種較為常見的植物木酚素,具有抗腫瘤血管發生、減弱真菌活性、消除體內自由基和抗癌作用(Xu et al., 2017)。

綜上所述,我們認為麗豆的營養價值與大豆相似,且其富含的一些次級代謝產物在改善人體多種疾病方面有積極的作用。此外,本研究結果也表明麗豆種子的代謝產物種類豐富,尤其有些對人體非常重要的次生代謝物,具有很高的開發價值,這些都為我們后期深入研究麗豆的營養價值以及科學地規劃人工栽培提供了參考和借鑒。