UPLC-MS/MS法檢測草魚中恩諾沙星殘留量的不確定度評估

李嬌 羅景陽 李巧蓮 王巖松 陳嬌 宣彤

作者簡介：李嬌（1989—），女，遼寧撫順人，碩士，工程師。研究方向：食品質量安全檢測。

摘 要：目的：評估超高效液相色譜-串聯質譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）法檢測草魚中恩諾沙星殘留量的不確定度。方法：依據《測量不確定度評定與表示（含第1號修改單）》（JJF 1059.1—2012）、《測量不確定度要求的實施指南》（CNAS-GL05—2011）、《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019），對草肉中恩諾沙星的殘留量進行不確定度評估分析。結果：當草魚中恩諾沙星的殘留量為183 ?g·kg-1時，其擴展不確定度為12 ?g·kg-1

（k=2），不確定度主要來源于體積不確定度、UPLC-MS/MS儀器的不確定度。結論：提高檢驗人員的實驗操作能力，定期校準UPLC-MS/MS儀，可提高檢測結果的準確性。

關鍵詞：不確定度；恩諾沙星；超高效液相色譜-串聯質譜（ UPLC-MS/MS）；草魚

Uncertainty Evaluation for the Determination of Enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS

LI Jiao1， LUO Jingyang1， LI Qiaolian1， WANG Yansong1， CHEN Jiao1， XUAN Tong2

（1.Shenyang Institute of Food and Drug Control， Shenyang 110122， China;

2.School of Public Health， Shenyang Medical College， Shenyang 110034， China）

Abstract： Objective： The uncertainty of measurement in determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS is evaluated. Method： According to relevant standards such as JJF 1059.1—2012， CNAS-GL05—2011 and CNAS-GL006： 2019， the uncertainty for the determination of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella by UPLC-MS/MS was established. Result： When the content of enrofloxacin in Ctenopharyngodon idella was 183 ?g·kg-1， the expanded uncertainty was 12 ?g·kg-1 （k=2）. The uncertainty mainly comes from volume uncertainty and UPLC-MS/MS instrument generated by the uncertainty. Conclusion： Improve the experimental operation ability of inspectors and regularly calibrate UPLC-MS/MS instrument to make it accurate.

Keywords： uncertainty; enrofloxacin; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（ UPLC-MS/MS）; Ctenopharyngodon idella

測量不確定度在一定程度上反映了實驗室檢測結果的準確性和可靠性，檢測結果的表述包括被測量的值及與該值相關的測量不確定度。恩諾沙星作為水產養殖中常用的喹諾酮類動物專用藥物，具有廣譜殺菌的作用。長期食用含有恩諾沙星殘留的魚類，可能導致恩諾沙星在人體內蓄積，從而對人體機能造成危害，甚至使人體產生耐藥性，影響人體的軟骨發育，導致畸形等病變。本文以第三方復檢樣品草魚為例，對高效液相色譜 - 串聯質譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， UPLC-MS/MS）測定恩諾沙星的測量不確定度進行分析，建立了測量不確定度評定方案[1]，以期為食用農產品中獸藥殘留的檢測提供技術支持，從而進一步保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

1.1.1 主要儀器設備

電子天平，賽多利斯儀器公司；超高效液相色譜串聯質譜儀，QTRAP 4500串聯質譜儀，美國應用生物系統公司；LC-20A型超高效液相色譜儀，島津企業管理公司；H2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；Milli-Q型超純水機，美國Millipore公司；1 mL移液器、2 mL移液管（A級）；100 mL容量瓶（A級）。

1.1.2 主要試劑

恩諾沙星標準物質（100 mg，純度99.24%，天津阿爾塔公司）；草魚（第三方檢測機構復檢樣品）；甲醇、乙腈（色譜純）；水（一級水）。

1.2 恩諾沙星的測定方法

稱取2 g（±0.02 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加入內標溶液200 μL，渦旋混合30 s，避光放置

10 min，加入10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，加入20 mL

酸化乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心收集上清液于50 mL梨形瓶中，重復提取，將合并的上清液于40 ℃水浴蒸干，用1 mL甲醇復溶，用

2 mL正己烷脫脂后，取下層清液過0.22 μm膜待測定[2]。本方法中恩諾沙星殘留量的計算公式為

式中：X為恩諾沙星的殘留量，μg·kg-1；C為由標曲擬合出的樣品溶液濃度，ng·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g；frec為回收率校正因子。

1.3 恩諾沙星標準儲備液的制備

準確稱取恩諾沙星標準物質0.010 0 g于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，再用移液管精確吸取2.0 mL標準溶液于100 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制成濃度為2 μg·mL-1的恩諾沙星標準儲備液。

2 不確定度的主要來源

通過分析，本方法不確定度的主要來源如圖1所示[3-4]。

圖1 不確定度的主要來源

3 不確定度量化

3.1 重復性引入的不確定度

在2.00 g草魚樣品中，加入0.175 mL濃度為

2 μg·mL-1恩諾沙星標準溶液制成加標樣，加標量為70 μg·kg-1，復檢樣品草魚中恩諾沙星的殘留量為183 μg·kg-1，加標后恩諾沙星的含量為253 μg·kg-1。加標樣6次重復測定的結果分別為

260 μg·kg-1、251 μg·kg-1、256 μg·kg-1、255 μg·kg-1、252 μg·kg-1和258 μg·kg-1，平均值為255 μg·kg-1，平均回收率為103.3%，標準偏差為3.593 4 μg·kg-1，實驗合成重復性引入的相對標準不確定度為

3.2 UPLC-MS/MS定量校準引入的不確定度

UPLC-MS/MS定量的允差為3.2%，在均勻分布下，其相對標準不確定度為。

3.3 標準品及樣品稱量引入的不確定度

使用賽多利斯BSA224S-CW天平，精度0.1 mg，最大允差為±0.1 mg，取均勻分布，標準品稱量引入的標準不確定度為u（sd） mg。

電子天平稱量不確定度主要為稱量變動性，根據電子天平技術參數，其變動性標準偏差為

0.01 g，實際操作過程中控制在0.02 g，按照均勻分布，則樣品稱量引入的標準不確定度為

u（w） g

因此，由標準品稱量10 mg及樣品稱量2 g引入的相對標準不確定度為

3.4 移液定容體積引入的不確定度

①100 mL容量瓶校準。根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[5]，當實驗室環境溫度為20 ℃時，100 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.10 mL，服從均勻分布，則不確定度為。②重復性試驗。對100 mL

容量瓶定容10次并用天平稱量，標準偏差為

0.067 9 mL，其不確定度為0.0679/=0.021 5 mL。③溫度試驗。實驗室環境溫度為（20±5）℃時，甲醇的體積膨脹系數為1.1×10-3/℃，在均勻分布下，不確定度為。因此，100 mL容量瓶引入的相對標準不確定度為

urel（V1）

①1 mL移液器校準。根據《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）規定[6]，1 mL移液器的容量允差為±1.0%，在均勻分布下，不確定度為1.0%/=0.005 80 mL。②重復性試驗。JJG 646-2006中重復6次測定的RSD≤0.5%，得到標準偏差為1.00×0.5%=0.005 mL，即其不確定度。③溫度試驗。實驗室的環境溫度為（20±5）℃，其不確定度為。因此，合成得

1 mL移液器的相對標準不確定度為

urel（V2）

在實驗過程中，2次用到了100 mL容量瓶，6次用到了1 mL移液器，因此，由移液定容體積引入的相對標準不確定度為

3.5 加標回收率實驗引入的不確定度

加標回收率實驗引入的不確定度包括樣品在提取凈化過程中及由于儀器波動、重現性等因素引入的不確定度，本文采用3水平3平行共9次加標回收試驗，加標量分別為25 μg·kg-1、70 μg·kg-1、

220 μg·kg-1，復檢樣品草魚中恩諾沙星的殘留量為183 μg·kg-1，加標后恩諾沙星的含量分別為208 μg·kg-1、253 μg·kg-1、403 μg·kg-1。回收率為92.0%～105.0%，平均回收率為99.8%，標準偏差為0.017 4 μg·kg-1，因此，加標回收率實驗引入的相對標準不確定度為

4 不確定度結果分析

將上述各相對標準不確定度合成，得到合成相對標準不確定度為

因此，當復檢樣品中恩諾沙星含量為183 μg·kg-1時，合成不確定度為uc=183 ×0.030 1=6 μg·kg-1。當包含因子k為2，置信概率p為95%，擴展不確定度U=2×6=12 μg·kg-1。

5 結論

草魚中恩諾沙星的含量為（183±12） μg·kg-1。通過對相對標準不確定度匯總分析，計算各個不確定度的貢獻率。由表1可知，在UPLC-MS/MS法測定草魚中恩諾沙星殘留量時，移液定容體積引入的不確定度對檢測結果影響最大，其次是UPLC-MS/MS定量校準引入的不確定度。因此，在日常檢測中，實驗室檢驗人員應注意提高實驗操作能力，同時定期對儀器進行校準，嚴格控制前處理過程，減少因移液定容體積引入的不確定度，有助于提高實驗室檢測數據的準確性和檢測結果可靠性[7-8]。

參考文獻

[1]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與管理：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.

[2]中華人民共和國農業部.中華人民共和國農業部公告 第1077號[EB/OL].（2008-08-11）[2023-10-10].https：//www.moa.gov.cn/nybgb/2008/djiuq/201806/t20180611_6151661.htm.

[3]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.化學分析測量不確定度評定：JJF 1135—2005[S].北京：中國計量出版社，2005.

[4]中國合格評定國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南：CNAS—GL006：2019[S/OL].（2019-04-09）[2023-10-10].https：//www.cnas.org.cn/rkgf/sysrk/rkzn/2019/04/896487.shtml.

[5]國家質量監督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器：

JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

[6]國家質量監督檢驗檢疫總局.移液器檢定規程：

JJG 646—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

[7]李貴軍，袁彩霞，洪霞，等．氣相色譜-質譜法測定黃瓜中氧樂果農藥殘留量的不確定度評定[J].現代食品，2021（13）：205-208.

[8]尹青春，陳小妹，陳春泉，等.UPLC-MS/MS法測定蝦中恩諾沙星含量的不確定度評估[J].廣東化工，2023，50（4）：203-206.