擬黑多刺蟻對倉鼠膽固醇代謝的影響

胡泓臣 沈菲凡 潘京金 王威艷 林慧祺 朱寒月

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（32001709）；廣東省基礎與應用基礎研究基金區域聯合基金項目（22202107190000486）；國家重點研發計劃項目（2022YFE0139500）。

作者簡介：胡泓臣（1998—），男，四川成都人，碩士在讀。研究方向：食品營養與安全。

通信作者：朱寒月（1991—），女，河南商丘人，博士，講師。研究方向：食品營養與安全。E-mail：zhuhanyue29@163.com。

摘 要：為研究擬黑多刺蟻對高膽固醇飲食倉鼠血脂和腸道菌群的影響，選用敘利亞金黃地鼠為模型，設置無膽固醇添加組（Non-Cholesterol Diet，NCD）、高膽固醇飲食組（High Cholesterol Dite，HCD）和添加擬黑多刺蟻粉末的高膽固醇飲食組（Polyrhachis vicina Roger High Chelosterol Diet，PRD），飲食干預六周后，PRD組倉鼠血清中總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）、非高密度脂蛋白膽固醇（Non-High-Density Lipoprotein Cholesterol，Non-HDL-C）質量濃度相比HCD組分別上升16.20%、95.48%、9.52%、22.88%，HDL-C/TC比值下降4.00%。與HCD組相比，PRD組倉鼠肝臟中HMG-CoA-R基因相對表達量顯著升高48.92%，肝臟膽固醇質量濃度升高52.38%，肝臟脂質質量濃度升高19.19%。綜上所述，飲食中添加擬黑多刺蟻會加劇倉鼠血脂異常，使肝臟中HMG-CoA-R基因表達水平升高、肝臟膽固醇和肝臟脂質濃度上升。本研究為指導擬黑多刺蟻的食用及相關食品開發提供了安全性參考。

關鍵詞：擬黑多刺蟻；膽固醇代謝；心血管疾病

The Effects of Polyrhachis vicina Roger on Cholesterol Metabolism in Hamsters

HU Hongchen， SHEN Feifan， PAN Jingjin， WANG Weiyan， LIN Huiqi， ZHU Hanyue*

（Foshan University， Foshan 528000， China）

Abstract： In order to investigate the effects of Polyrhachis vicina Roger on blood lipids and gut microbiota in hamsters subjected to a high cholesterol diet， Syrian golden hamsters were selected as the model. Three groups were established： a group with non-cholesterol supplementation （NCD）， a high cholesterol diet group （HCD）， and a high cholesterol diet group supplemented with Polyrhachis vicina Roger powder （PRD）. After six weeks of dietary intervention， compared to the HCD group， the PRD group exhibited an increase of 16.20% in total cholesterol （TC）， 95.48% in triglycerides （TG）， 9.52% in high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， and 22.88% in non-high-density lipoprotein cholesterol （Non-HDL-C） concentration in the hamster serum， while HDL-C/TC ratio decreased by 4.00%. Compared with the HCD group， the relative expression of HMG-CoA-R gene in the liver of the hamsters in the PRD group was significantly increased by 48.92%， the mass concentration of liver cholesterol was increased by 52.38%， and the mass concentration of liver lipid was increased by 19.19%. In conclusion， the inclusion of Polyrhachis vicina Roger in the diet exacerbated blood lipid abnormalities in hamsters， leading to elevated 3-Hydroxy-3-Methylgtutaryl-CoA Reductase （HMG-CoA-R） gene expression levels， increased cholesterol and lipid concentrations in the liver. This study provides a safety reference for the consumption of Polyrhachis vicina Roger and the development of related food products.

Keywords： Polyrhachis vicina Roger; cholesterol metabolism; cardiovascular disease

近年來，心血管疾病（Cardiovascular Disease，CVD）已經成為全球范圍內致死人數最多的疾病，血脂異常是心血管疾病的重要危險因素。血脂異常主要表現為血液中總膽固醇（Total Cholesterol，TC）、非高密度脂蛋白膽固醇（Non-High-Density Lipoprotein Cholesterol，Non-HDL-C）和甘油三酯（Triglyceride，TG）質量濃度升高（本文中“含量”“濃度”均代表質量分數）和高密度脂蛋白膽固醇（High-Density Lipoprotein Cholesterol）濃度降低。血脂異常會引起眾多心血管疾病，如動脈粥樣硬化、脂肪肝、冠心病、心梗、心律失常等[1]。

擬黑多刺蟻（Polyrhachis vicina Roger），又名雙齒多刺蟻、大黑螞蟻、大黑蟻等，是節肢動物門、昆蟲綱、膜翅目蟻科昆蟲，廣泛分布于中國、印度、馬來西亞、斯里蘭卡和孟加拉國，國內主要分布在廣西、廣東、安徽等地[3]。1993年，國家衛生部將擬黑多刺蟻定為藥食兩用無害的優良蟻種，作為傳統的可食用昆蟲，其在民間的食用方式有烹調后食用、泡酒飲用、曬干后食用等。作為中藥材，擬黑多刺蟻具有解毒消腫、活血化瘀、抗炎鎮靜、補腎益精等功效，常被用來治療失眠、痔瘡、脫發、月經不調等癥[2]。以往的研究顯示，擬黑多刺蟻中含有多種氨基酸、微量元素[3]及脂肪酸[4]，經熱風干燥后，其蛋白質含量高達56.6%[5]。但目前尚未有擬黑多刺蟻對血脂影響的研究報道。

倉鼠是公認的研究膽固醇代謝的優秀模型，本研究以擬黑多刺蟻為研究對象，以倉鼠為實驗模型，模擬人們高膽固醇飲食習慣，探究擬黑多刺蟻對高膽固醇模型倉鼠血脂的影響，對心血管疾病的防治和人們健康水平的提升具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擬黑多刺蟻采集自廣西橫縣，秋冬至立春時段進行采集，除去雜物后自然晾干，冷凍干燥72 h，磨成粉末后貯存在-20 ℃冰箱用于后續實驗。

實驗選用倉鼠品種為敘利亞金黃地鼠，購于北京維通利華實驗動物有限公司（動物生產許可證號SCXK（京）2022-0051，動物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0235），雄性，7周齡；膽固醇、蛋氨酸，購于Sigma生物試劑有限公司；TC、TG、HDL-C試劑盒，購于美國Stanbio公司；膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、去氧膽酸、N，O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺配制試劑[N， O-Bis （Trimethylsilyl） Trifluoroacetamide with Trimethylchlorosilane，TMS]，購于上海麥克林生化科技有限公司；WCGENE mRNA cDNA合成試劑盒、WCGENE mRNA qPCR定量試劑盒，購于上海沃吉基因。

1.2 儀器與設備

高速離心機，型號為Eppendorf 5424R；高速離心機，型號為湘儀L550；紫外可見分光光度計，型號為普析TU-1810；高效氣相色譜儀，型號為安捷倫7890b；冷凍干燥機，購于寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 擬黑多刺蟻成分分析

根據《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》（GB 5009.168—2016）第二法測定脂肪酸組成及含量；根據《食品安全國家標準 食品中膽固醇的測定》（GB 5009.128—2016）第二法測定膽固醇含量；根據《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》

（GB 5009.124—2016）測定氨基酸組成及含量；根據《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》

（GB 5009.5—2016）第一法測定蛋白質含量；根據《食品安全國家標準 預包裝食品營養標簽通則》

（GB 28050—2011）測定碳水化合物含量；根據《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）

第二法測定脂肪含量。

1.3.2 制備鼠糧

將倉鼠分為3組，即無額外膽固醇飲食組（Non- Cholesterol Diet，NCD），模擬中國人飲食習慣，滿足倉鼠每日所需膽固醇以外不添加額外膽固醇；高膽固醇飲食組（High Cholesterol Dite，HCD），在NCD組基礎上，額外添加膽固醇，其添加量相當于成年人每日攝入一個雞蛋的膽固醇；添加擬黑多刺蟻粉末的高膽固醇飲食組（Polyrhachis vicina Roger High Chelosterol Diet，PRD）。在實驗預備階段，測得擬黑多刺蟻粉末蛋白質含量為53.3%，碳水化合物含量為16.2 g/100 g，脂肪含量為10.4 g/100 g。PRD組鼠糧以擬黑多刺蟻粉末為部分蛋白質來源，替代50%酪蛋白，同時相應地減少豬油與淀粉的添加量，以確保與HCD鼠糧的能量含量相同，詳細配方見表1。

1.3.3 動物喂養與樣本采集

24只敘利亞金黃地鼠適應喂養一周后，將其隨機分為3組，每組8只，每兩只一籠，于23 ℃，每天光照12 h的環境飼養，每周記錄兩次體重、攝食量。第0周開始與第6周結束時分別對每只鼠進行尾部采血，使用試劑盒測其血液中TC、TG、HDL-C濃度，第6周喂養結束時將鼠進行二氧化碳窒息處死，取部分組織，用生理鹽水沖洗并稱重，所有組織存放于-80 ℃冰箱直至分析。

1.3.4 血脂數據測定

根據相應試劑盒說明書指示分別測定與計算金黃地鼠血液中的TC、TG、HDL-C含量，使用SPSS軟件進行數據統計學分析。

1.3.5 肝臟膽固醇含量分析

使用氯仿-甲醇溶液提取100 mg肝臟樣品中的脂質，加入1 mg 5α-膽甾烷作為內標；經皂化后使用TMS將未皂化部分中的膽固醇轉化為TMS-醚衍生物，使用安捷倫7890b高效氣相色譜儀進行定量分析。

1.3.6 肝臟脂質含量測定

對幾種主要的肝臟脂肪酸進行了測定[6]，稱取100 mg肝臟，加入十七酸為內標定量總脂質；混合物經氯仿-甲醇（2∶1，V/V）萃取后，收集底層相，氮氣干燥后在BF3中甲基化，總脂質轉化為脂肪酸甲酯，再使用高效氣相色譜儀進行測定。

1.3.7 實時熒光定量PCR

應用實時熒光定量PCR技術檢測了肝臟中與膽固醇代謝相關基因的表達水平，測定的基因有Sterol Regulatory Element Binding Protein 2（SREBP2）、LDL Receptor（LDLR）、3-Hydroxy-3-Methylgtutaryl-CoA Reductase（HMG-CoA-R）、Cholesterol-7α-Hydroxylase（CYP7A1），使用RNA提取劑從小腸或肝臟中分離出總RNA并將其轉化為各自的互補DNA，使用熒光染料和StepOnePlus實時熒光定量系統進行PCR分析。

1.3.8 數據分析

數據分析使用IBM SPSS Statistics軟件，版本26，所有數據均采用單因素方差分析，然后進行Fisher的LSD檢驗，顯著性定義為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 擬黑多刺蟻成分分析

結果顯示，擬黑多刺蟻粉末蛋白質含量為53.3%，氨基酸含量為45.8 g/100 g，氨基酸種類共16種，其中包括7種人體必需氨基酸，占總氨基酸質量的33.82%，缺少人體必需的色氨酸，膳食中的色氨酸可以有效降低血液中膽固醇含量，并有利于預防Ⅱ型糖尿病。

從擬黑多刺蟻中共檢測出17種脂肪酸，其中飽和脂肪酸10種，占總脂肪酸質量的27.00%，不飽和脂肪酸7種，占總脂肪酸質量的73.00%；膽固醇含量為108 mg/100 g，碳水化合物含量為16.20%。

2.2 倉鼠排便情況

在攝食量和體重無顯著差異的情況下，在飼養的最后一周，NCD、HCD、PCD 3組平均每籠排出糞便質量為4.50 g、3.20 g和12.08 g，PCD組糞便質量較高，這是受擬黑多刺蟻粉末中幾丁質影響。擬黑多刺蟻粉末中，除去碳水化合物、脂肪、蛋白質、水分，計算得到其幾丁質含量約為15.10%，幾丁質是一種由生物體自身合成的多糖，是昆蟲和其他節肢動物外骨骼、呼吸系統和消化排泄系統的主要成分，可以與其他糖結合形成幾丁質-聚糖。近年來，對幾丁質的研究主要集中在其作為膳食纖維對腸道及腸道菌群的影響。幾丁質的生理作用與其他膳食纖維一樣，幾丁質通過促進腸道蠕動和改變腸道菌群組成來幫助消化與排泄。

2.3 血脂分析

血清中TC、HDL-C、TG、Non-HDL-C質量濃度受機體膽固醇代謝影響，是判斷血脂異常與否的重要依據。對血脂水平與CVD發生率定量分析顯示，TC、HDL-C、TG質量濃度升高與CVD的發生呈現正相關性，在TC水平正常時，Non-HDL-C占比越低，表明機體患CVD的可能性越小，血脂指標異常人因CVD死亡的風險高于血脂正常人群20%～40%[7]。飼養6周后，與HCD組相比，PRD組倉鼠TC、HDL-C、TG、Non-HDL-C質量濃度分別顯著上升16.20%、9.52%、95.48%和22.88%，HDL-C/TC顯著降低4.00%，PRD組倉鼠患CVD以及死于CVD的概率高于HCD組，見表2。

2.4 肝臟膽固醇含量

肝臟是膽固醇體內合成、存儲、清除的主要場所，MARETTI-MIRA等[8]研究表明，肝臟將內源膽固醇與外源膽固醇以脂蛋白的形式運輸至血液中，外源膽固醇主要指食物中的膽固醇，約占機體總膽固醇的30%。肝臟內膽固醇的穩態由多種機制維持，包括肝臟細胞對膽固醇的合成、攝取、儲存和排泄。LI等[9]指出肝臟內膽固醇穩態對肝臟健康以及血脂穩態的重要意義，肝臟內膽固醇積累過多會導致肝臟和血液病變，造成非酒精性脂肪肝與動脈粥樣硬化。NCD、HCD、PRD 3組倉鼠肝臟膽固醇質量濃度分別為2.31 mg·g-1、11.53 mg·g-1、17.57 mg·g-1，與HCD組相比，PRD組倉鼠肝臟膽固醇質量濃度升高52.38%（圖1），其患CVD的風險大大增加。

不同字母表示差異具有顯著性，P＜0.05。

2.5 肝臟脂質含量

肝臟是脂質代謝和轉運的關鍵器官，高脂飲食的小鼠肝臟中脂質的累積會引起血液中TG濃度升高，TEN等[10]證實了脂質在肝臟中異常積累會導致非酒精性脂肪肝，LINDENMEYERL等[11]指出肝臟中脂質含量增多會增加患CVD和惡性腫瘤的風險。結果顯示，PRD組的總脂質濃度較HCD組顯著升高19.99%（P＜0.001），表明食用含擬黑多刺蟻增加了脂質在肝臟中的積累，提示其患CVD與非酒精性脂肪肝的風險增大（表3）。

2.6 相關基因表達水平

膽固醇在體內的運輸、轉化、代謝受到多種基因調控。在肝臟中，CYP7A1基因是膽固醇轉化為膽汁酸的關鍵限速酶[12]，HMG-CoA-R是內源膽固醇在肝臟中合成的主要限速酶，它利用乙酰輔酶A、還原型輔酶Ⅱ和ATP生成甲羥戊酸鹽，這是膽固醇生物合成的前體物質，LDLR負責將血液中的Non-HDL-C轉運至肝臟中進行代謝，SREBP2負責調控LDLR與HMG-CoA-R的基因表達[13]。

PCR結果顯示，與HCD組相比，PRD組倉鼠肝臟中HMG-CoA-R基因相對表達量顯著升高（48.92%），CYP7A1基因相對表達量升高34.27%，但無顯著性差異（圖2），表明PRD組倉鼠肝臟中合成的膽固醇和酸性固醇增多，血液中膽固醇濃度與肝臟膽固醇濃度息息相關，肝臟中未被及時清理的膽固醇會隨血液進入體循環導致血液膽固醇濃度上升。

3 結論

擬黑多刺蟻自身高膽固醇含量與缺乏色氨酸造成了其對血脂的不利影響，幾丁質顯著影響了倉鼠的消化系統，其排便量增多，肝臟中HMG-CoA-R基因表達水平上升，肝臟中合成的膽固醇增多，脂質累積增多，導致血液中膽固醇濃度升高，倉鼠患CVD概率升高。

作為食用昆蟲，擬黑多刺蟻具有繁殖速度快、分布范圍廣等優點，含有豐富蛋白質和優質脂肪酸，且具有一定藥用價值，但以往未有研究報道其可能對心血管疾病帶來的影響。本實驗結果表明擬黑多刺蟻會加劇食用者血脂異常，這個結論為將來探索、開發昆蟲類食品并評估其安全性提供了新的視角。

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