正交試驗優化荊芥中總黃酮的提取工藝

谷彩花 陳衛 郝學政 信龍飛 張莉 張艷玲

基金項目：河南省科技攻關項目（222102110338）；河南省高等學校重點科研項目（24A210023，24B210014）；信陽農林學院優秀基層教學組織建設項目（YXJCJXZZ202007）；信陽農林學院農學院本科生科研訓練項目（SRTP202303）。

作者簡介：谷彩花（1991—），女，河南周口人，碩士，助教。研究方向：中藥工藝優化與中藥資源。

通信作者：張艷玲（1973—），女，河南信陽人，碩士，副教授。研究方向：中藥材栽培與中藥資源。E-mail：2009180048@xyafu.edu.cn。

摘 要：本文以信陽淮濱荊芥為材料，以總黃酮含量為考察指標，通過單因素和正交試驗對粉碎粒度、浸泡時間、超聲時間、超聲溫度等提取工藝條件進行了優化。結果表明，最佳提取條件為粉碎粒度80目、浸泡時間10 min、超聲時間15 min、超聲溫度50 ℃，該條件下荊芥中總黃酮含量平均值為77.52 mg·g-1。

關鍵詞：荊芥；總黃酮；超聲波法；正交試驗

Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Schizonepeta tenuifolia by Orthogonal Experiment

GU Caihua1， CHEN Wei2， HAO Xuezheng3， XIN Longfei1， ZHANG Li1， ZHANG Yanling1*

（1.School of Agricultural Sciences， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang 464000， China;

2.School of Pharmacy， Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang 464000， China;

3.Henan Economic Crops Promotion Station， Zhengzhou 450000， China）

Abstract： This article uses Xinyang Huaibin Schizonepeta tenuifolia as the material and total flavonoid content as the evaluation index. The extraction process conditions， such as crushing particle size， soaking time， ultrasound time， and ultrasound temperature， were optimized through single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal extraction conditions were crushing particle size of 80 mesh， soaking time of 10 minutes， ultrasonic time of 15 minutes， and ultrasonic temperature of 50 ℃. Under these conditions， the average total flavonoid content in Schizonepeta tenuifolia was 77.52 mg·g-1.

Keywords： Schizonepeta tenuifolia; total flavone; ultrasonic method; orthogonal test

荊芥（Schizonepeta tenuifolia Briq.）為唇形科植物，莖呈方柱形，上部有分枝，穗狀花絮[1]，在河南、山東等地均有分布。作為一種夏季常食蔬菜，既能生食又可熟食，可用于做湯羹、面食、涼拌、餡料、調料等，氣味濃郁，味道鮮美，能去除魚蝦之腥味，防暑并增強人們食欲。已有文獻報道荊芥含有揮發油、黃酮類、多糖等[2]多種成分，目前針對其中的揮發油類的研究較多，但關于荊芥中黃酮類成分的報道較少，且以信陽淮濱荊芥為材料的研究尚無報道。黃酮類成分的提取方法主要有索氏提取法、水浴法、微波提取法、CO2超臨界萃取法和超聲提取法等，其中超聲提取法最為便捷、高效。現代藥理研究證明，黃酮類成分具有較強的抗炎、抗氧化、抑菌等[3-4]藥理活性，但該成分受提取溫度、時間、藥材粒度、浸泡時間等多方面因素的影響較大。基于此，本文以信陽淮濱荊芥為材料，以總黃酮含量為考察指標，通過單因素和正交試驗確定最佳提取工藝，為提高荊芥中總黃酮的含量提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荊芥采集于信陽市淮濱縣，經信陽農林學院張艷玲副教授鑒定為唇形科植物荊芥的干燥地上部分，經粉碎、過篩后備用。

無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁，均為分析純；蘆丁標準品（99.51%，MUST-21011510），成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SP-1920紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司；QCE20500 40 kHz超聲波清洗機，上海冠特超聲儀器有限公司；800A多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

參照孫國艷等[5]的方法并略做修改。精確稱取

5 mg蘆丁標準品于50 mL容量瓶中，用少量無水乙醇使蘆丁標準品溶解，再用60%乙醇溶液定容至刻度線，即為標準液。精密吸取上述標準品溶液

0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，將其分別置于10 mL容量瓶中，各加入24%乙醇使其總容積為5 mL，然后精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置5 min；精密加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，加24%乙醇定容至刻度，搖勻，放置

10 min，以第一管為空白對照，于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），得到的蘆丁標準曲線方程為Y=0.714X-0.000 7，R2=0.996 6。

1.3.2 供試品溶液制備

參照劉英翠等[6]的方法，精密稱取荊芥樣品粉末約1 g，共3份，置于具塞三角瓶中，分別加入60%乙醇溶液30 mL，按待考察工藝參數對荊芥中的總黃酮進行超聲提取30 min，將過濾后的濾液轉移至100 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試樣品溶液。

1.3.3 樣品的測定

按照標準曲線的方法，精密量取試樣溶液

1.0 mL于10 mL容量瓶中，取蒸餾水作為空白溶液，采用紫外分光光度計于510 nm處測定樣品吸光度，代入回歸曲線計算樣品總黃酮含量[7]。計算公式為

（1）

式中：X總黃酮為荊芥中總黃酮含量，mg·g-1；

C為荊芥總黃酮質量濃度，mg·mL-1；V為測定樣品液總體積，mL；M為荊芥干粉質量，g。

1.4 單因素試驗設計

每組精密稱取荊芥1 g，以總黃酮含量為評價指標[8]，以粒度65目、浸泡時間15 min、超聲溫度

40 ℃、超聲時間20 min為基本條件，分別考察粉碎粒度（24目、50目、65目、80目和100目）、浸泡時間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）、超聲溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃）和超聲時間（5 min 、10 min、15 min、20 min和25 min）對總黃酮含量的影響。

1.5 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以粉碎粒度、浸泡時間、超聲時間、超聲溫度為因素，采用L9（34）進行正交試驗設計，因素水平設計見表1。

1.6 數據分析

使用Excel進行數據整理以及圖表繪制，使用SPSS 19.0軟件進行正交試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 粉碎粒度對荊芥中總黃酮含量的影響

由圖1可知，荊芥粉碎粒度在24～100目時，總黃酮含量呈先升高后下降的趨勢。當粉碎粒度為

80目時，總黃酮含量達到最高，初步分析原因可能是荊芥的粉碎粒度越小，黃酮類成分在溶液中越易析出；但過100目篩后黃酮含量明顯降低，這可能是荊芥粉末過細，除黃酮類外的其他化學成分和雜質也隨之溶出，且在實際操作時，由于荊芥質地較輕，過篩時會有部分原料浪費。因此，選擇最佳粉碎粒度為80目。

2.1.2 浸泡時間對荊芥總黃酮含量的影響

由圖2可知，荊芥浸泡時間在5～25 min時，總黃酮含量的變化趨勢為先升高后降低。當浸泡時間為15 min時，荊芥中的總黃酮含量達到最高，初步分析可能是浸泡可促進細胞吸水膨脹，體積增大，原料與提取液接觸面積增大，內部小分子隨之溶出；但浸泡時間超過15 min時，黃酮類含量呈下降趨勢，可能是因為細胞壁吸水膨脹破裂，黃酮類成分被溶解的同時其他化學成分也被溶解出來，干擾黃酮類成分的測定。因此，選擇最佳浸泡時間為15 min。

2.1.3 超聲時間對荊芥總黃酮含量的影響

由圖3可知，荊芥超聲時間在10～25 min時，隨著超聲時間的延長，總黃酮含量呈先升高后降低再略微升高的變化趨勢。當超聲時間為15 min時，荊芥中總黃酮的含量達到最高點，繼續延長超聲時間，則黃酮含量降低。初步分析可能是超聲加速了細胞內黃酮類分子的運動頻率，但隨著超聲時間的延長，荊芥中雜質溶出、黃酮化合物分解[9]或結構受到了破壞，含量便隨之降低。因此，選擇最佳超聲時間為15 min。

2.1.4 超聲溫度對荊芥總黃酮含量的影響

由圖4可知，超聲溫度在20～60 ℃時，隨著溫度的升高，總黃酮含量呈先升高后降低的趨勢。當溫度為50 ℃時，總黃酮含量最高。初步分析可能是溫度升高，分子做布朗運動的速度加快，促進了溶劑與荊芥粉末的接觸，從而增加了黃酮類物質的溶出，而溫度高于50 ℃時，部分對溫度變化比較敏感的黃酮類物質如酚式結構類被破壞，導致提取率下降[10]。因此，選擇最佳超聲溫度為50 ℃。

2.2 正交試驗結果與分析

由表2分析可知，以荊芥中總黃酮含量為考察指標，由極差R值可知，4個因素對總黃酮含量的影響程度為粉碎粒度（A）＞超聲溫度（D）＞超聲時間（C）＞浸泡時間（B）。分析K值得出的較優組合為A3B1C1D2，與正交表中較優組合A3B1C3D2不一致，因此進行進一步分析。由表3方差分析可知，影響超聲波法提取荊芥中總黃酮的最大因素A（粉碎粒度）對應的F值為92.14，界于F0.05和F0.01之間，具有顯著性，而因素B（浸泡時間）、C（超聲時間）、D（超聲溫度）均無顯著性影響，結合生產實際，超聲時間越短，生產周期越短，效率越高。綜合分析確定本試驗的最優組合為A3B1C1D2，即粉碎粒度80 目，浸泡時間10 min，超聲時間15 min，超聲溫度50 ℃。

2.3 最佳工藝條件的驗證

稱取3等份1 g荊芥樣品，根據試驗所得最優組合進行荊芥提取工藝驗證，按照1.3項下方法進行荊芥總黃酮提取并計算含量，結果見表4。荊芥總黃酮含量的RSD為0.38%，表明試驗確定的荊芥總黃酮提取工藝條件穩定，重復性較好。荊芥總黃酮含量（77.52 mg·g-1）高于正交試驗表中所得結果，說明該工藝條件具有可行性。

3 結論

本文以信陽淮濱荊芥為材料，以總黃酮含量為指標，采用超聲波提取法，通過單因素試驗和正交試驗對粉碎粒度、浸泡時間、超聲時間和超聲溫度4個因素進行考察，得出荊芥總黃酮的最佳提取工藝為粉碎粒度80 目、浸泡時間10 min、超聲時間

15 min、超聲溫度50 ℃，此條件下荊芥中總黃酮含量平均值為77.52 mg·g-1，明顯高于文獻報道[11]的數據，說明該方法高效、可行，且重現性好，具有廣闊的應用前景。

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