DJ-1通過保護線粒體復合體I活性介導白藜蘆醇減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷*

任建民，劉慧茹，劉 松，李曉琪，何 康，湯 蕾，陳和平

（南昌大學藥學院江西省基礎藥理學重點實驗室，江西 南昌 330006）

缺血性心臟疾病對全球的公共健康構成重大威脅，臨床管理的最佳策略是通過溶栓方法或經皮冠狀動脈介入治療恢復冠狀動脈血流［1］。然而，當阻塞的冠狀動脈重新開放時，缺血心肌會因血液供應的突然增加而進一步受損，這一過程被稱為心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［2］。心肌I/R 損傷機制涉及氧化應激損傷、凋亡、線粒體功能障礙等因素［3］。其中氧化應激是指正常氧化劑清除酶系統［如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶和谷胱甘肽］和細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生之間的不平衡，會通過多種途徑直接引起心肌細胞的凋亡、自噬、炎癥等損傷［4］。已有研究表明，線粒體復合體I 是線粒體中ROS產生的主要場所，心肌I/R 期間ROS過量產生的主要原因與線粒體復合體I的氧化損傷有關［5-6］。DJ-1（又稱帕金森病蛋白7，Parkinson disease protein 7，PARK7）作為一種多功能保護性蛋白，具有線粒體功能調節和促進細胞存活等功能［7-8］。此外，在正常生理狀態下，DJ-1 定位在細胞質，而在應激條件下，DJ-1 會易位至線粒體［9-10］。值得注意的是，據報道，DJ-1與線粒體復合體I 的兩個亞基ND1 （NADH dehydrogenase subunit 1）和NDUFA4 ［NADH dehydrogenase（ubiquinone） 1 alpha subcomplex 4］結合，有助于復合體I 的穩定性，而DJ-1敲除或突變導致線粒體復合體I 活性降低，增加對ROS 和線粒體復合物I 抑制劑的敏感性，DJ-1 表達的恢復緩解了這種現象［9，11］。上述研究表明，DJ-1蛋白在維持線粒體復合體I活性中發揮著關鍵作用。

白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種天然多酚類化合物，富含于花生、葡萄和漿果等食物中，因其抗炎和抗氧化特性而聞名，同時具有緩解心肌I/R 損傷的保護作用［12-13］，還可緩解糖尿病誘導的大鼠心功能障礙［14］。已有研究表明，DJ-1 介導RES 預處理而減輕缺氧復氧后H9c2 細胞損傷［15］；DJ-1 通過維持線粒體復合體I的活性參與H9c2 細胞缺氧預適應延遲保護作用［16］。但是DJ-1是否介導RES預處理對抗心肌I/R 所誘發的氧化應激損傷機制尚不完全清楚。因此，本研究擬在整體水平上探討RES對心肌I/R 誘發的氧化應激損傷及DJ-1蛋白的影響，并明確其機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級健康雄性SD 大鼠均購自南昌大學動物實驗中心，體重在220～240 g 之間，其中動物使用許可證號SYXK（贛）2023-0019。大鼠均在標準實驗室中喂養，飼養條件為：空氣濕度保持在（50±2）%，溫度保持在（25±2） ℃，12 h 光/暗交替，并提供充足的食物及水。

2 主要試劑

RES 和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液購自北京索萊寶科技有限公司；線粒體復合體I 活性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DJ-1 和ND-1 抗體購自Abcam；NDUFA4 抗體購自Proteintech；GAPDH 抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；COX IV 抗體購自Sigma-Aldrich；羊抗兔IgG 多克隆抗體購自杭州華安生物技術有限公司；組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；MitoSOXTMRed 檢測試劑盒購自Invitrogen；線粒體復合體I抑制劑IACS-010759購自TargetMol；sh-DJ-1和陰性對照（negative control，NC）慢病毒構建于上海吉凱基因科技有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠I/R 模型的構建及分組 通過腹腔注射

10%水合氯醛來麻醉SD 大鼠。參照文獻［17］，麻醉完成后，將大鼠連接小動物專用呼吸機，通過用6-0 絲線活結結扎冠狀動脈左前降支誘發心肌缺血。心肌缺血30 min 后，解開活結，開始2 h 的血流再灌注。大鼠隨機分為6 組：sham 組（開胸后只穿線，不進行結扎）、I/R 組、RES+I/R 組、NC+RES+I/R 組、sh-DJ-1+RES+I/R 組和IACS-010759+RES+I/R 組。心肌I/R 前1 周大鼠接受RES（20 mg/kg）灌胃，每日一次。其中對IACS-010759+RES+I/R 組大鼠 在I/R 術前2 d 給予IACS-010759（10 mg/kg）灌胃。此外，sham 和I/R 組大鼠均通過灌胃接受等體積的生理鹽水。

3.2 慢病毒心肌內注射 麻醉完成后，將SD 大鼠固定于手術臺，用止血鉗逐層鈍性分離左側胸大肌后，正確暴露左心室及心尖部位置，繞過血管于左心室的上部分取兩點、左心室下部分取兩點及心尖部取一點，用微量注射器分別注射滴度為5×108TU/L的sh-DJ-1 或NC 慢病毒50 μL，針尖于心肌水平面呈60°左右的角度進針，進針深度約2 mm，緩慢注射完畢后，用棉簽立即止血。術后1 周內，經心肌內注射的大鼠均腹腔注射8×104U 的青霉素鈉防止感染。1周后，NC+RES+I/R 和sh-DJ-1+RES+I/R 組大鼠均接受RES（20 mg/kg）灌胃7 d，每日一次。

3.3 Western blot 收集心臟組織裂解物，或用組織線粒體分離試劑盒分離線粒體和細胞質的蛋白質。通過SDS-PAGE 分離，并轉移到PVDF 膜中，用5%脫脂乳密封2 h。在4 ℃下Ⅰ抗孵育過夜，將Ⅱ抗在室溫下與膜孵育1 h，然后用ECL 發光液鑒定印跡，最后用ImageJ軟件對蛋白條帶灰度值進行定量分析。

3.4 免疫共沉淀法 蛋白提取完成后，將上清液離心分離，并進行蛋白定量后備用。取500 μg 蛋白樣品，加入1 μL的DJ-1抗體，在4 ℃下緩慢搖動孵育過夜；加入20 μL 的蛋白A/G 瓊脂糖，在室溫下孵育2 h后，進行3 次洗滌，離心去除上清液；加入1× SDS 蛋白上樣緩沖液；進行Western blot 實驗以檢測DJ-1 與ND1和NDUFA4蛋白的相互作用。

3.5 心臟超聲檢查 造模結束后，使用小動物超聲成像系統計算各組大鼠左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

3.6 心肌梗死面積測定 再灌注結束后，迅速取出大鼠心臟，將其切成大約2 mm 厚的薄片，然后將這些薄片放入2% TTC 染液中處理15 min；用多聚甲醛固定心肌組織，并使用相機對其進行拍攝；用ImageJ軟件計算心肌梗死面積。

3.7 心臟組織中線粒體ROS 測定 心肌組織冰凍切片用MitoSOX 染液在37 ℃條件下避光孵育30 min后，使用激光共聚焦顯微鏡對激發和發射信號進行檢測，波長分別為498 和522 nm。最后用ImageJ 軟件計算相對熒光強度。

3.8 心臟組織中線粒體復合體I活性測定 準備好心肌組織純化分離提取的線粒體待測樣品，置于冰槽里，通過酶標儀調整單波長為340 nm（溫度為30 ℃），根據試劑盒說明書計算出線粒體復合體I活性。

3.9 血清中LDH 活性、MDA含量和SOD 活性測定 大鼠造模后，通過心臟穿刺取血，血液在37 ℃條件下靜置20 min 后，在4 ℃、3000 r/min 離心20 min，收集血清備用。按照檢測試劑盒說明書來測定血清中LDH活性、SOD活性和MDA含量。

4 統計學處理

數據以均數±標準差（mean±SD）表示。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行方差齊性檢驗和單因素方差分析。P＜0.05表明差異具有統計學意義。

結 果

1 RES預處理對大鼠心功能的影響

心臟超聲結果顯示，與sham 組相比，I/R 組大鼠LVEF 和LVFS 均顯著下降（P＜0.01）；與I/R 組相比，RES+I/R 組 和NC+RES+I/R 組 大 鼠LVEF 和LVFS 均顯著升高（P＜0.01）；與RES+I/R 組相比，sh-DJ-1+RES+I/R組和IACS-010759+RES+I/R 組大鼠LVEF和LVFS 均顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），即心功能下降，見圖1。

Figure 1. Comparison of rat cardiac function in each group. LVEF： left ventricular ejection fraction； LVFS： left ventricular fractional shortening. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖1 各組大鼠心功能的比較

2 RES預處理對大鼠心肌梗死面積的影響

TTC 結果顯示，與I/R 組相比，RES+I/R 組和NC+RES+I/R 組大鼠心肌梗死面積顯著減?。≒＜0.01）；與RES+I/R 組相比，sh-DJ-1+RES+I/R組和IACS-010759+RES+I/R 組大鼠心肌梗死面積顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

Figure 2. Comparison of rat myocardial infarction size in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖2 各組大鼠心肌梗死面積的比較

3 RES 預處理對大鼠血清中氧化應激水平及LDH的影響

與sham 組相比，I/R 組血清中LDH 活性和MDA含量均升高，SOD活性降低（P＜0.01）；與I/R組相比，RES+I/R 組和NC+RES+I/R 組血清中LDH 活性和MDA 含量均降低，SOD 活性升高（P＜0.01）；與RES+I/R組相比，sh-DJ-1+RES+I/R 組 和IACS-010759+RES+I/R 組血清中LDH 活性和MDA 含量均升高，SOD活性降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

Figure 3. Comparison of MDA content （A），LDH activity （B） and SOD activity （C） in the serum of rats in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖3 各組大鼠血清中MDA含量、LDH活性和SOD活性的比較

4 RES預處理對大鼠心肌組織線粒體復合體I和線粒體ROS的影響

與sham組相比，I/R組心肌組織中線粒體復合體I活性顯著降低，伴隨著線粒體ROS的釋放水平顯著升高（P＜0.01）；與I/R 組相比，RES+I/R 組和NC+RES+I/R 組心肌組織中線粒體復合體I 活性顯著升高，伴隨著線粒體ROS 的釋放水平顯著下降（P＜0.01）；與RES+I/R組相比，sh-DJ-1+RES+I/R 組和IACS-010759+RES+I/R 組心臟組織線粒體復合體I活性均顯著下降，線粒體ROS 的釋放水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。

Figure 4. Comparison of mitochondrial complex I activity （A） and mitochondrial ROS level （B； MitoSOX staining，scale bar=20 μm） in the myocardial tissue of rats in each group. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖4 各組大鼠心肌組織中的線粒體復合物I活性和線粒體ROS水平的比較

5 RES 預處理對大鼠心肌組織中DJ-1 表達及線粒體轉位的影響

接下來通過觀察敲減DJ-1表達對RES誘導的心肌保護作用的影響，敲減效率如圖5A 所示（P＜0.01）。Western blot 結果顯示，與sham 組相比，I/R組大鼠心肌組織中總DJ-1 蛋白水平顯著升高，且RES 預處理進一步升高總DJ-1 蛋白水平（P＜0.01），見圖5B。

Figure 5. Comparison of DJ-1 expression in the myocardium of rats in each group. A： the knockdown efficiency of sh-DJ-1 in myocardial tissue assessed by Western blot； B： total protein level of DJ-1 detected by Western blot. Mean±SD. n=5. △△P＜0.01 vs sham+NC group； ##P＜0.01 vs sham group； **P＜0.01 vs I/R group； ▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖5 各組大鼠心肌組織中DJ-1表達的比較

與I/R 組相比，RES 預處理顯著促進DJ-1蛋白在線粒體的轉位，這通過DJ-1 在線粒體與胞漿的DJ-1蛋白水平比值升高所證實（P＜0.01），而sh-DJ-1+RES+I/R 組 和IACS-010759+RES+I/R 組DJ-1 蛋 白在線粒體的轉位均受到抑制（P＜0.01），見圖6。

Figure 6. Comparison of the mitochondrial translocation of DJ-1 in the myocardial tissue of rats in each group. COX IV and GAPDH were used as mitochondrial and cytoplasmic loading controls，respectively. The ratio of mitochondrial DJ-1 protein level to cytoplasmic one was used to assess the translocation of DJ-1 into mitochondria. Mean±SD. n=5. ##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs I/R group； ▲▲P＜0.01 vs RES+I/R group.圖6 各組大鼠心肌組織中DJ-1在線粒體轉位的比較

6 RES 預處理對大鼠心肌組織中DJ-1 與線粒體復合體I核心亞基ND-1和NDUFA4相互作用的影響

免疫共沉淀結果顯示，與sham 組相比，I/R 組心肌組織中DJ-1 與ND-1/NDUFA4 的相互作用增強，且RES 預處理進一步增強這種相互作用；與RES+I/R組相比，sh-DJ-1+RES+I/R 組和IACS-010759+RES+I/R 組DJ-1 與ND/NDUFA4 的相互作用均顯著減弱，見圖7。

Figure 7. Evaluation of the interaction between DJ-1 and ND-1/NDUFA4 in the myocardial tissue of rats in each group.The representative images from five independent experiments were obtained by co-immunoprecipitation assay.圖7 各組大鼠心肌組織中DJ-1與ND-1/NDUFA4的相互作用

討 論

近年來，再灌注療法是治療缺血性心臟病最常見和最有效的方法，然而，它也是臨床治療中心肌I/R 損傷的主要原因［18］。心肌I/R 損傷的主要原因已被廣泛研究，包括鈣超載、炎癥、氧化應激等［19］。其中氧化應激在心肌I/R 損傷扮演著越來越重要的角色，心肌I/R 期間ROS的過度生成對心肌細胞造成不可逆轉的傷害，從而加劇心功能障礙［20］。已有研究表明，線粒體內產生的ROS是導致I/R 損傷的特殊驅動因素，包括誘導線粒體功能障礙和對其他分子的氧化損傷［21］。值得注意的是，在心肌I/R 期間，線粒體復合體I生成過度的線粒體ROS，從而致使ROS的過度釋放［22］。這正如預期，本研究中，心肌I/R 后，線粒體復合體I 活性下降，氧化應激水平增加，表現為血清中MDA 含量增多、SOD 活性下降以及線粒體ROS 的大量釋放。許多研究已經表明，RES 作為一種天然多酚化合物，具有多種藥理活性，如抗炎和抗氧化作用等，更重要的是，RES 預處理可視為干預心肌I/R損傷的一種重要措施，并且治療效果顯著［23-24］。本研究表明，給予RES 后，上述I/R 誘導的氧化應激損傷現象全部被逆轉，同時可改善心功能，縮小心肌梗死面積，有效證實RES可減輕大鼠I/R 誘導的氧化應激損傷，但是其深入機制尚不明確。

DJ-1 在幾乎所有生物中均有表達且高度保守，具有伴侶蛋白、氧化還原傳感和線粒體穩態活性［25］。敲減DJ-1表達，可明顯增加心力衰竭的易損性，從而加劇心功能障礙［26］。有報道稱，RES 通過增強DJ-1的表達進而減輕腦I/R 損傷［27］。值得注意的是，之前的研究已經表明，DJ-1作為一種內源性保護蛋白，在H9c2細胞缺氧/復氧后顯著上調，并參與缺氧預處理對缺氧/復氧誘導的氧化應激的延遲心臟保護作用［28-29］。在這項研究中，RES 顯著促進DJ-1 在心肌I/R 后的表達，同時促進DJ-1 在線粒體的亞定位。值得注意的是，據報道DJ-1在維持線粒體復合體I活性和減輕氧化應激損傷方面發揮重要作用［30-31］。此外，DJ-1 蛋白可以直接與ND1 和NDUFA4 結合，有助于復合體I的組裝和功能維持［32］。基于以上報道，可以假設RES的抗氧化應激作用可能是通過DJ-1保持復合體I 活性并隨后防止線粒體ROS 產生來介導的。本研究發現，RES增加心肌I/R 后DJ-1在線粒體的易位，之后與ND1/NDUFA4的相互作用增強，進一步支持DJ-1 在RES 在保護線粒體復合體I 活性的潛在作用。隨后，與RES+I/R 組相比，心肌內敲減DJ-1表達會使線粒體復合體I活性下降，伴隨著氧化應激水平增加，更重要的是，心肌梗死面積擴大，加劇心功能障礙。接下來，為了探討線粒體復合體I在DJ-1介導RES 預處理的保護作用，對大鼠線粒體復合體I活性進行抑制，結果顯示，與RES+I/R 組相比，IACS-010759+RES+I/R 組線粒體復合體I 活性急劇下降，削弱了RES減輕心肌I/R 所致氧化應激損傷的作用，同時加劇心功能障礙。這些數據表明RES 通過DJ-1保護線粒體復合體I 的活性，減弱I/R 誘導的氧化應激，從而具有心臟保護作用。

綜上所述，RES 通過上調DJ-1的表達，促進DJ-1在線粒體的亞定位后，與線粒體復合體I的兩個亞基ND-1/NDUFA4 的相互作用增強，進而保護線粒體復合體I 的活性，產生對抗I/R 導致的氧化應激損傷的心肌保護作用。