鹽酸環(huán)丙沙星的微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

周東方，朱菊紅*，董秀玉，朱飛松

(1.浙江華潤(rùn)三九眾益制藥有限公司，浙江 麗水 323000；2.東陽(yáng)市醫(yī)療保障中心，浙江 東陽(yáng) 322100；3.浙江孚諾醫(yī)藥股份有限公司，浙江 東陽(yáng) 322100)

0 引言

微生物限度檢查法系指檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括需氧菌總數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌總數(shù)、控制菌檢查[1]。鹽酸環(huán)丙沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥物[2]，可通過(guò)抑制細(xì)菌DNA 的合成和復(fù)制使細(xì)菌死亡，導(dǎo)致在日常進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在干擾和數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因喹諾酮類抗生素具有強(qiáng)烈的抑菌性，可采用改變培養(yǎng)基pH，供試液加入鎂離子或鈣離子，薄膜過(guò)濾加離心方法都能有效中和喹諾酮類制劑產(chǎn)品的抑菌性[3-7]。改變培養(yǎng)基pH 對(duì)需氧菌、霉菌和酵母菌生長(zhǎng)有影響，不利于日常準(zhǔn)確檢測(cè)鹽酸環(huán)丙沙星受污染程度。鹽酸環(huán)丙沙星溶于水，為了減少實(shí)驗(yàn)和人為誤差，本次試驗(yàn)在不改變各項(xiàng)試劑性質(zhì)的條件下用最少的步驟進(jìn)行鹽酸環(huán)丙沙星的微生物限度檢查，采用加大稀釋倍數(shù)，加入中和劑(氯化鈣、硫酸鎂)，薄膜過(guò)濾法三者結(jié)合對(duì)其抑菌性進(jìn)行中和后進(jìn)行微生物限度計(jì)數(shù)、控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)，證實(shí)采用的方法可有效消除其抑菌性，計(jì)數(shù)方法適用性回收率在50%～200% 范圍內(nèi)，控制菌(大腸埃希菌) 適用性試驗(yàn)滿足要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

BHC-1300IIA2 生物安全柜(蘇潔醫(yī)療器械)；LMQ.C-100E 立式滅菌器(山東新華醫(yī)療)；XG1.D 脈動(dòng)真空滅菌柜(山東新華醫(yī)療)；FD260 熱風(fēng)循環(huán)烘箱(德國(guó)binder 賓得)；mL203T/03 電子天平(梅特勒托利多)；FE28pH 計(jì)(梅特勒托利多)；HTY-305S 微生物限度檢測(cè)儀(浙江泰林生物)；LRH-250F 生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器)；HYC-940 醫(yī)用冷藏箱(青島海爾)；DW-86W100 醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾)。

1.2 藥品

鹽酸環(huán)丙沙星(批號(hào)：D2112006，浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10 104］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F) 98 003］、大腸埃希菌［CMCC(B)44 102］。購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，傳代為第2 代，菌液使用為第3 代。注：下列正文中菌種名稱采用菌種編號(hào)代替。

1.4 培養(yǎng)基與試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、麥康凱液體培養(yǎng)基(MCB)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MCA)、pH 值為7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液(SCP)以上干粉培養(yǎng)基均購(gòu)于北京三藥科技有限公司；硫酸鎂(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán))，氯化鈣(化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán))。下列正文中培養(yǎng)基名稱采用培養(yǎng)基通用縮寫(xiě)代替。

1.5 菌液、培養(yǎng)基、溶液制備

將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉和大腸埃希菌制備參照《中國(guó)藥典》2020 版通則1105、1106“菌種及菌液制備”進(jìn)行新鮮濃菌液的制備。將濃菌液逐步進(jìn)行稀釋，使其最后的菌液計(jì)數(shù)結(jié)果不大于100 cfu/mL，菌液在2～8 ℃保存，在24 h 內(nèi)有效。

培養(yǎng)基的制備參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制與滅菌，按照《中國(guó)藥典》 2020 版通則1105 項(xiàng)下“表1 試驗(yàn)菌液的制備和使用”中的“計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查”規(guī)定，接種不大于100 cfu 的菌液至TSB 或TSA 平板或SDA平板中；用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行同法操作。將所有培養(yǎng)物在表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)，每天計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)束后把被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值在0.5～2.0 范圍內(nèi)，表示結(jié)果滿足要求，該培養(yǎng)基可在進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)中使用。

表1 微生物限度計(jì)數(shù)方法適用性回收率

無(wú)菌0.5 g/mL 硫酸鎂溶液配制方法：稱取20 g硫酸鎂，加40 mL 純化水使溶解，過(guò)濾，去除雜質(zhì)，置100 mL 藍(lán)蓋瓶中，121 ℃濕熱滅菌15 min，冷卻備用。

無(wú)菌0.6 g/mL 氯化鈣溶液配制方法：稱取24 g氯化鈣，加40 mL 純化水使溶解，過(guò)濾，去除雜質(zhì)，置100 mL 藍(lán)蓋瓶中，121 ℃濕熱滅菌15 min，冷卻備用。

1.6 供試液的制備

(1) 稱取供試品約10 g 至無(wú)菌質(zhì)均袋中，加0.5 g/mL 硫酸鎂溶液5 mL 和溫度不超過(guò)45 ℃的SCP 至100 mL，混合均勻，制成1∶10 供試液，再取1∶10 供試液30 mL 至無(wú)菌錐形瓶中，加0.5 g/mL硫酸鎂溶液5 mL，加SCP 至300 mL，制成1∶100 供試液，待用。

(2) 稱取供試品約10 g 至無(wú)菌質(zhì)均袋中，加0.6 g/mL 氯化鈣溶液5 mL 和溫度不超過(guò)45 ℃的SCP 至100 mL，混合均勻，制成1∶10 供試液，再取1∶10 供試液30 mL 至無(wú)菌錐形瓶中，加0.6 g/mL氯化鈣溶液5 mL，加SCP 至300 mL，制成1∶100 供試液，待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物限度計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.1.1 試驗(yàn)樣品溶液的制備

(1) 試驗(yàn)組：取5 支無(wú)菌試管，分別加入A 供試液9.9 mL，再分別加入表1 中菌液0.1 mL(含菌量為500 ～1 000 cfu)，混勻待用(每1 mL 供試液中含不大于100 cfu 菌量)。

(2) 供試品對(duì)照組：取1 支無(wú)菌試管，加入A 供試液9.9 mL 和0.1 mLSCP，混勻待用。

(3)菌液對(duì)照組：取5 支無(wú)菌試管，分別加入SCP 9.9 mL，再分別加入表1 中菌液0.1mL(含菌量為500～1 000 cfu)，混勻待用(每1mL 緩沖液中含不大于100 cfu 菌量)。

(4) 中和劑對(duì)照組：取5 支無(wú)菌試管，分別加入0.5 g/mL 硫酸鎂溶液9.9 mL，再分別加入表1 中菌液0.1 mL(含菌量為500～1 000 cfu)，混勻待用(每1 mL溶液中含不大于100 cfu 菌量)。

(5) 陰性對(duì)照組：取SCP 1 mL 注入薄膜過(guò)濾器的濾膜上，同法操作。

(6)取B 供試液同法進(jìn)行試驗(yàn)。

(7)回收率計(jì)算公式：

2.1.2 檢測(cè)

(1) 操作步驟：在薄膜過(guò)濾器上放置孔徑為0.45 μm 的無(wú)菌濾膜，扣入無(wú)菌濾杯，在無(wú)菌濾杯中加入10 mL SCP 潤(rùn)濕濾膜，濾過(guò)。分別取上述混合后供試液(中和劑)1 mL 注入濾膜上，用SCP 沖洗，每次沖洗量為100 mL，分別沖洗5 次、7 次，過(guò)濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于TSA 平板和SDA 平板上，每種菌平行制備兩個(gè)平皿，倒置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

①TSA 培養(yǎng)時(shí)間：CMCC(B)26 003、CMCC(B)10 104、CMCC(B)63 501 菌株在30～35 ℃培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3 d，CMCC(F)98 001、CMCC(F)98 003 菌株在30～35 ℃培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 d。

②SDA 培養(yǎng)時(shí)間：CMCC(F)98 001、CMCC(F)98 003 菌株在20～25 ℃培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5 d。

2.1.3 結(jié)果要求

結(jié)果要求：試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在50%～200%范圍內(nèi)，中和劑對(duì)照組與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在50%～200% 范圍內(nèi)，陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、圖1 和圖2 所示。

圖1 500 mL 沖洗量回收率對(duì)比

圖2 700 mL 沖洗量回收率對(duì)比

由表1、圖1 和圖2 可直觀地看到使用0.5 g/mL硫酸鎂溶液作為中和劑，沖洗500 mL 時(shí)，金黃色葡萄球菌回收率有一次小于50%，不符合藥典要求；銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率在75%～82%之間，相比700 mL 沖洗量，回收率偏低。

使用0.6 g/mL 氯化鈣溶液，沖洗量在500 mL 和700 mL 時(shí)，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于50%，不符合藥典要求。所以0.5 g/mL 硫酸鎂溶液沖洗500 mL 和0.6 g/mL 氯化鈣溶液無(wú)法完全中和鹽酸環(huán)丙沙星抑菌性。

2.2 控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn)

2.2.1 增菌培養(yǎng)

(1)試驗(yàn)組：取A 供試液100 mL 于薄膜過(guò)濾器的濾膜上，濾過(guò)，用SCP 沖洗，每次沖洗量為100 mL，分別沖洗5 次、7 次，在最后一次沖洗液中加入1 mL不大于100 cfu 的大腸埃希菌菌液，過(guò)濾，取出濾膜，接種至200 mL TSB 培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)箱(30～35 ℃)中培養(yǎng)18～24 h。

(2) 陽(yáng)性對(duì)照組：取SCP 100 mL 注入薄膜過(guò)濾器的濾膜上，加入1 mL 不大于100 cfu 的大腸埃希菌菌液，過(guò)濾，用SCP 沖洗，同法操作。

(3) 供試品組：取A 供試液100 mL 于薄膜過(guò)濾器的濾膜上，同法操作。

(4)中和劑、陰性對(duì)照組：分別取100 mL 中和劑(0.5 g/mL 硫酸鎂溶液) 和SCP 按照供試品組同法操作。

2.2.2 選擇和分離

取上述TSB 培養(yǎng)物，輕搖混勻，各取1 mL 分別接種100 mL MCB 中，置培養(yǎng)箱(42～44 ℃)中培養(yǎng)24～48 h。取MCB 培養(yǎng)物分別劃線接種至MCA 平板上，置培養(yǎng)箱(30～35 ℃)中培養(yǎng)18～72 h。

2.2.3 B 供試液操作方法

取B 供試液同A 供試液方法進(jìn)行相同操作。

2.2.4 結(jié)果要求

試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)檢出大腸埃希菌，供試品組、中和劑組、陰性對(duì)照組不得檢出大腸埃希菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

2.2.5 試驗(yàn)結(jié)果

A 供試液：使用0.5 g/mL 硫酸鎂溶液作為中和劑，500 mL 和700 mL 時(shí)控制菌大腸埃希菌檢測(cè)均能滿足要求；B 供試液：使用0.6 g/mL 氯化鈣溶液作為中和劑，試驗(yàn)組在沖洗量為500 mL 時(shí)未能檢測(cè)出對(duì)應(yīng)的大腸埃希菌，在沖洗量為700 mL 時(shí)可以檢出。表明使用0.6 g/mL 氯化鈣溶液作為中和劑，在500 mL時(shí)鹽酸環(huán)丙沙星的抑菌效力沒(méi)有完全除去，如果使用0.6 g/mL 氯化鈣溶液作為中和劑，控制菌大腸埃希菌的檢測(cè)，沖洗量要在700 mL 及以上。

2.3 討論

2.3.1 供試液的制備方式

因喹諾酮類有較強(qiáng)的抑菌能力，本方法學(xué)采用加0.6 g/mL 氯化鈣溶液和0.5 g/mL 硫酸鎂溶液分別進(jìn)行中和，用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行微生物限度計(jì)數(shù)方法學(xué)適用性試驗(yàn)。結(jié)果顯示加0.6 g/mL 氯化鈣溶液5 mL可中和一定的抑菌性，但需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)回收率低于50%，無(wú)法滿足藥典要求。若加大中和量，兩者反應(yīng)生成的螯合物在薄膜上形成阻斷，影響薄膜孔徑，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果存在干擾，此現(xiàn)象在進(jìn)行中和劑量選擇試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，故未進(jìn)行后續(xù)適用性試驗(yàn)。

2.3.2 沖洗次數(shù)的確認(rèn)

本研究對(duì)薄膜過(guò)濾的沖洗次數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，當(dāng)沖洗次數(shù)為5 次時(shí)，微生物計(jì)數(shù)檢查中的需氧菌總數(shù)有個(gè)別菌類回收率小于50%；控制菌檢查使用0.6 g/mL氯化鈣溶液時(shí)，沖洗5 次試驗(yàn)組無(wú)法檢出對(duì)應(yīng)的菌，不滿足藥典要求。

3 結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)利用0.5 g/mL 的硫酸鎂溶液中的鎂離子與鹽酸環(huán)丙沙星結(jié)構(gòu)中3、4 位的羧基和酮羰基形成螯合物，中和其抑菌能力，采用薄膜過(guò)濾法，用pH 值為7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗過(guò)濾，可以有效地進(jìn)行鹽酸環(huán)丙沙星微生物限度計(jì)數(shù)和控制菌檢測(cè)；利用0.6 g/mL 氯化鈣溶液中的鈣離子中和其抑菌能力，采用薄膜過(guò)濾法，可以有效地進(jìn)行控制菌檢測(cè)。

本試驗(yàn)方法的建立，提供了消除鹽酸環(huán)丙沙星本身抑菌作用的方法，試驗(yàn)結(jié)果滿足《中國(guó)藥典》 2020 版通則1105、1106、1107 要求，可為喹諾酮類的微生物限度檢查方法的研究提供借鑒思路。