徐黃合劑的制備工藝優化及含量測定

程濤， 馬詩瑜，宋平，卞曉嵐,*， 鄭嵐，葉騰飛

(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院盧灣分院藥劑科，上海 200020；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院藥劑科，上海 200025)

0 引言

徐黃合劑，本方來源于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院中醫科、名老中醫夏翔教授的多年臨床經驗，由黃芪、徐長卿、蒲黃、淫羊藿四味藥組成，具有益氣活血利脈，溫陽消斑除瘀的功效。現代藥理學研究表明[1]，該方活血化瘀、保護心肌、調節血脂、調節血糖的功效，對氣虛血瘀證型冠心病、糖尿病性下肢動脈硬化閉塞癥及大血管病變有良好的治療作用，已在醫院廣泛應用多年。徐黃合劑重用黃芪為君藥，使脾胃之元氣得以大補，從而令氣旺而血行，瘀去則絡通[2]。故在現代中藥制劑研究中，以君藥黃芪中的主要成分黃芪甲苷為制劑工藝和含量測定的主要考察指標，采用正交試驗方法確定最佳提取工藝并初步建立含量測定方法。本試驗為最大程度地保留原制劑的特色，擬將其制成合劑，通過提取、濃縮等工藝，提高制劑有效成分含量，減少藥物服用量，從而方便服用及攜帶，為后續大量生產質量穩定、可控的徐黃合劑提供實驗依據。

1 試驗藥品及主要儀器

1.1 儀器

高效液相色譜儀(HPLC，島津公司，LC-2020PLUS)，高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD，大連依利特分析儀器有限公司，ELSD-UM5000)，電子分析天平(梅特勒托利多公司FA104)。

1.2 試藥

黃芪、徐長卿藥材購于上海同濟堂藥業，蒲黃、淫羊藿苷藥材購于安徽盛海堂中藥飲片有限公司，所有藥材在使用前經鑒定，均符合《中藥藥典》2020 版各藥材項下相關規定。黃芪甲苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號120924)；含量測定用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 徐黃合劑制備工藝優化

2.1.1 正交實驗設計

按處方比例稱取黃芪、徐長卿、蒲黃、淫羊藿藥材，以A 加水量(倍)、B 煎煮時間(h)、C 煎煮次數(次)為主要考察因素每個因素設置三個水平，選用L9(34)正交試驗設計表安排試驗，提出的藥液進行過濾、合并、濃縮至相同體積。采用高效液相色譜法測定制劑中黃芪甲苷含量，并以之為主要參考指標，優化提取工藝，各因素水平設計如表1 所示，試驗及方差分析結果如表2 和表3 所示。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗優選結果

表3 方差分析結果

由正交試驗結果方差分析可知，在設計水平范圍內，各樣品比較均無顯著性差異。采用直觀分析，以黃芪甲苷為指標所得最優結果為 A2B2C3。對于黃芪甲苷來說，該成分一般在實驗室中可以采用索氏提取的方法，通過多次回流提取來提高提取效率。但在實際大批量生產過程中，從省時節能、降低成本方面綜合考慮，最終確定徐黃合劑提取工藝條件A2B1C2，即加入 藥材6 倍量的水，每次提取1 h，共提取2 次。

2.1.2 驗證試驗

按照處方比例稱取制劑所需的藥材，加入6 倍量的水，浸泡30 min，煎煮2 次，每次提取沸后保持1 h，趁熱過濾，合并藥液，濃縮至250 mL。測得3 批樣品黃芪甲苷含量分別為0.214、0.218 和0.216 mg/mL，RSD為0.93%，結果表明在該制備工藝條件下，制劑中黃芪甲苷含量較穩定，工藝合理、可行。

2.1.3 濃縮工藝研究

按處方量稱取全方藥材，根據最優提取工藝，合并所有提取的藥液，平行制備12 份供試品，供試品1～6 采用常壓濃縮，供試品7～12 采用減壓濃縮(-0.085 MPa，60～80 ℃)。采用 t 檢驗方法(Origin 7.5統計軟件)對兩種工藝條件下測定的黃芪甲苷轉移率比較，結果兩種濃縮工藝對黃芪甲苷含量無顯著影響(P＞0.05)，且黃芪甲苷轉移率均較高，結果如表4 所示。

表4 不同濃縮方法的考察結果

表5 精密度試驗考察結果

2.2 樣品含量測定方法學

2.2.1 色譜條件

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(OS034223，4.6×250 mm, 5 μm)；流動相組成為乙腈-水(34∶66)；流速為1.0 mL/min；ELSD 參數：蒸發區溫度為90 ℃；霧化區溫度40 ℃；氣流速度為1.50 mL/min；進樣體積為20 μL。理論塔板數按黃芪甲苷計算，不低于4 000。

2.2.2 樣品溶液的制備

對照品溶液制備：精密稱定黃芪甲苷對照品9.96 mg，加甲醇溶解，最后定容至10 mL 搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

供試品溶液制備：精密移取徐黃合劑20 mL，加入水飽和正丁醇20 mL，搖勻萃取，按照上述方法萃取3 次，分取、合并正丁醇層，加入氨試液30 mL 洗滌，重復洗滌3 次。濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL。0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

陰性樣品溶液制備：按處方比例去除黃芪藥材，同上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗

分別吸取“2.2.1”項下3 種樣品溶液，注入HPLC，陰性樣品在對照品相應位置無其他封出現，結果表明：該制備方法及色譜條件下陰性樣品無干擾。結果如圖1～圖3 所示。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 陰性樣品溶液色譜圖

2.2.4 標準曲線的準備

以“2.2 項下”對照品溶液為母液，制備濃度分別為 0.048 16 mg/mL、0.096 32 mg/mL、0.192 6 mg/mL、0.481 6 mg/mL、0.963 2 mg/mL 的標準品溶液。以黃芪甲苷量的自然對數(lnm)為橫坐標(X)，色譜峰面積的自然對數(lnA)為縱坐標(Y)，并進行回歸計算，求得黃芪甲苷回歸方程為y=1.614 9x+1.341 9，r2=0.999 4，線性范圍為0.048 16～0.963 2 mg/mL。

2.2.5 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，連續進樣6 次，記錄峰面積，計算黃芪甲苷RSD，結果表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗

精密移取徐黃合劑，按照“2.2.1”項下供試品制備方法制備6 份樣品，過0.45 μm 微孔濾膜后，注入HPLC，測定黃芪甲苷含量，測定表明該樣品處理方法和含量測定方法重復性良好，制劑中黃芪甲苷平均含量為0.213 8 mg/mL。數據如表6 所示。

表6 重復性試驗考察結果

2.2.7 穩定性試驗

取制備的徐黃合劑適量，按照“2.2.1”項下供試品制備方法制備樣品溶液，過0.45 μm 微孔濾膜后，將供試品溶液保存于室溫下，每隔2 h 或更長的時間測一次黃芪甲苷的峰面積，并計算RSD 值，結果樣品在12 h 內穩定性良好，如表7 所示。

表7 穩定性考察結果

2.2.8 準確性試驗

取已知濃度的徐黃合劑9 份，分別精密加入低、中、高三個劑量對照品溶液，制成供試品溶液，HPLC法測定峰面積，計算樣品回收率。經計算平均回收率為101.84%，RSD 為2.45%，結果表明該分析方法準確性符合規定，如表8 所示。

表8 準確性試驗考察結果

3 討論

徐黃方劑在長期的臨床實踐中取得顯著的治療效果，擴大其臨床應用是必然趨勢。傳統湯劑在使用中，存在服用不便、質量難控、量大難喝、攜帶不便等缺點[3]。綜合考慮臨床應用及產品特點，本實驗在徐黃方湯劑基礎上開發徐黃合劑。合劑能保留方藥中多種有效成分，以發揮中藥多組分、多靶點的治療特點，并且合劑口服吸收快，生物利用度高，可達到快速緩解患者病情的目的[4-5]。

黃芪甲苷是徐黃合劑中君藥黃芪的主要有效成分，具有良好的心臟保護作用，在動物實驗研究中，其表現出明顯的改善心臟功能與血流動力學作用[6]，加強心肌收縮力的同時[7]，不增加心肌耗氧量，減少心肌梗死面積，降低心律失常發生率等，因此黃芪甲苷可作為藥效指標性成分之一。本試驗采用的黃芪甲苷含量測定方法主要參考了《中國藥典》 2020 版一部黃芪項下含量測定相關內容，試驗結果表明黃芪甲苷在0.048 16～0.963 2 mg/mL 范圍內呈現出良好的線性關系，陰性樣品無干擾，儀器精密度、方法重復性、準確性均在相關要求范圍內，說明黃芪甲苷含量測定方法成熟[8-9]、穩定、重復性好，能夠滿足工藝考察要求，故本研究選取黃芪甲苷為含量測定評價指標，研究結果可作為制劑質量標準研究的一部分。

徐黃組方中，與其功能主治相關的化學成分具有較好的水溶性，宜采用水提法，以保留原方特色和藥效物質基礎。同時水提法具有操作相對簡單，生產成本較低，藥物制劑具有巨大的經濟優勢。但中藥復方制劑成分復雜，提取工藝的優劣直接影響有效成分的控制及臨床療效[10]。本實驗選取加水量、提取次數、煎煮時間三個因素，采用正交試驗法對水提工藝條件進行考察，試驗結果通過方差分析和直觀分析，確保提取工藝的可靠和合理。本試驗結果表明，3 個因素對制劑的提取無顯著影響，最終從生產效率、資源節約及實際生產操作等因素綜合考慮，確定徐黃合劑最佳提取工藝為加入藥材量6 倍水，浸泡30 min，煎煮沸后1 h，提取2 次。驗證試驗結果表明，該提取工藝穩定，為今后徐黃合劑大批量生產建立了初步工藝流程。

綜上，本研究以臨床上療效確切的驗方徐黃方為研究對象，將其設計制備成合劑，既符合傳統用藥特點，又滿足開發有效成分明確的現代中藥理念，符合中藥現代化發展方向。研究影響徐黃合劑提取工藝的主要因素，優化制劑制備工藝，利用現代分析技術明確制劑有效成分含量，為生產大批量穩定性高、有效成分可靠、質量可控的徐黃合劑提供實驗基礎。