酶解荷葉制備荷葉小分子多肽的研究

郝曉華， 劉可心

（忻州師范學院生物系，山西忻州 034300）

荷葉是睡蓮科植物蓮 （Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥葉。 對荷葉營養成分及其水提取物抗氧化活性研究表明，荷葉中氨基酸種類比較齊全，富含人體所必需的氨基酸，如亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸等，總氨基酸含量達133 g/kg（劉軍波等，2015）。 而干荷葉粉中的蛋白質含量達到了22.9%（楊月欣，2013）。荷葉還含有生物堿、黃酮、多糖及多酚等功能性成分，有降脂減肥、抗炎抑菌、鎮定安神抗疲勞的作用（王嬋等，2020）。 另外，研究表明，荷葉的甲醇提取物有很強的抗氧化活性（紀麗蓮等，2001），其抗氧化性與BHA 相當，略高于α–生育酚，可抑制約74%的亞麻酸氧化。 目前，對荷葉的研究僅限于加工、選育、成分分析等，對其功能成分的研究多集中于荷葉的生物堿、黃酮、多糖等（李偉民等，2020），局限于荷葉蛋白的優化提取。

小分子肽又稱寡肽，一般由2 ～10 氨基酸組成，是蛋白質結構的功能片段。小分子肽具有易吸收、無抗原性、生物活性強等優于蛋白質的特點，具有更高的營養價值（叢峰松，2018）。

酶解法與其他制備多肽的方法相比較， 其具有高重復率、快捷、安全、可控等特點，因而被廣泛使用。 堿性蛋白酶是pH 在9 ～11 下可以水解蛋白質肽鍵的酶，與其他蛋白酶進行比較，堿性蛋白酶可以催化生成高耐消化性、高抗氧化性、分子質量更小的抗氧化肽（闞旭輝等，2016）。 近年來，有很多以綠豆、大豆、玉米等為原材料制備多肽的研究（馬瑞等，2019；任健等，2013；王梅等，2012）。這些更多作為糧食食用， 而荷葉一般用作中草藥和觀賞使用，與綠豆、大豆、玉米等相比，荷葉利用率較低。本文通過優化酶解荷葉制備小分子多肽，以更好地利用荷葉蛋白資源，提高荷葉的利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器 微型植物式樣粉碎機； 電子天平；超聲波細胞粉碎機；水浴恒溫振蕩器；低速離心機；電熱鼓風干燥箱；酶標儀；紫外可見分光光度計；冷凍干燥機。

1.1.2 主要材料與試劑 荷葉： 淘寶松草堂旗艦店；氫氧化鈉、無水乙醇、牛血清清蛋白、考馬斯亮藍（G-250）、85%磷酸、95%乙醇、CAS 9014-01-1堿性蛋白酶（2.0×105U/mg）：合肥千盛生物科技有限公司；BC 3185 雙縮脲法蛋白質含量檢測試劑盒：索萊寶生化試劑盒事業部。所用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 荷葉多肽的制備 參考尹佳等（2020）試驗方法，制備荷葉小分子多肽。 先將干荷葉置于粉碎機中粉碎，再過80 目篩，得到荷葉粉。 稱取2.0 g荷葉粉按照料液比1:20 加入蒸餾水40 mL，搖勻。 加入1 mol/L 的標準NaOH 溶液調節酸堿度，達到堿性蛋白酶的最適pH（9 ～11），再加入0.2 g的堿性蛋白酶，并在43 ℃和固定90 W 的超聲波輔助條件下進行酶解，酶解90 min。 酶解完成后在沸水水浴85 ℃下滅酶25 min。 冷卻至室溫后，4000 r/min 離心25 min，取上清液，將上清液放入冷凍干燥機中干燥，然后放在冰箱冷藏室備用。

1.2.2 單因素試驗設計 在酶加量5000 U/g 的條件下，設置底物濃度（酶與底物質量比值）、酶解溫度、酶解時間、酶解pH 四個單因素，分別選底物濃度為2%、3%、4%、5%、6%， 酶解溫度為45、50、55、60、65 ℃，酶解pH 為6、7、8、9、10，酶解時間為3、4、5、6、7 h 四個因素對上一步得到的荷葉多肽做單因素試驗，每個試驗重復三次。考察各因素對多肽濃度的影響，選取最佳酶解條件。

1.2.3 響應面試驗設計 參考饒勝其等（2015）和孫菁茹等（2020）研究進行響應面試驗。 根據單因素試驗結果和Box-Benhnken 中心組合試驗原理，以底物濃度、酶解溫度、酶解pH、酶解時間四個因素為自變量， 多肽濃度為響應值。 利用Design Expert 10.0 軟件， 每個因素設定5 個水平進行試驗，且每個因素重復三次，作4 因素3 水平的因素水平編碼表（表1）。 利用Design Expert 10.0軟件，對回歸模型進行分析，根據各參數兩兩之間的交互作用對多肽含量的影響， 作響應曲面3D圖和等高線圖。

表1 四因素三水平表

1.2.4 標準曲線的繪制 采用Bradford 法測定蛋白質的濃度，詳情見表2。 準確稱量0.100 g 牛血清清蛋白，用蒸餾水進行溶解，溶解后用蒸餾水定容至100 mL。 得到1 mg/mL 牛血清清蛋白標準溶液。 準確稱量0.050 g 考馬斯亮藍G-250 溶于25 mL 95%乙醇中，加入50 mL 85%磷酸，用蒸餾水定容至500 mL，得到考馬斯亮藍試劑。 分別在7 支試管中加入0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL 的牛血清清蛋白標準溶液， 分別用蒸餾水補齊至0.20 mL，再分別加入5.00 mL 的考馬斯亮藍試劑于7 支試管中， 混合均勻5 ～20 min后，在595 nm 處比色測定，并在Excel 中以標準蛋白含量為橫坐標， 吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

表2 蛋白濃度測定

1.2.5 多肽濃度的測定 采用雙縮脲法蛋白質含量檢測試劑盒， 分別將40 μL 蒸餾水和200 μL試劑一加入0.5 mL EP 管中， 混合均勻后在室溫下靜置15 min，取200 μL 于96 孔板，在540 nm下比色測定，將該EP 管作為空白管并記為A1。分別將40 μL 標準液和200 μL 試劑一加入0.5 mL EP 管中， 混合均勻后在室溫下靜置15 min，取200 μL 于96 孔板，在540 nm 下比色測定，將該EP 管作為標準管并記為A2。 分別將40 μL 待測液和200 μL 試劑一加入0.5 mL EP 管中，混合均勻后在室溫下靜置15 min， 取200 μL 于96 孔板，在540 nm 下比色測定，將該EP 管作為待測管并記為A3。 蛋白質濃度的計算公式如下：

式中：CA1為A1的多肽濃度，mg/mL；A1為空白管；A2為標準管；A3為待測管。

1.2.6 試驗數據處理 采用Excel 軟件做標準曲線和四個因素分別影響多肽含量的圖， 采用Design Expert 10.0 軟件對響應面數據進行方差分析， 得到多元二次響應面回歸模型并根據各參數兩兩之間的交互作用對多肽含量的影響， 作響應曲面3D 圖和等高線圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制 以牛血清清蛋白含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，牛血清清蛋白標準曲線如圖1 所示。回歸方程為：y=8.1232x+0.024，R2=0.9979。

圖1 蛋白質溶液標準曲線

2.2 單因素試驗設計結果及分析

2.2.1 底物濃度對多肽含量的影響 根據圖2 可知，底物濃度為2%時，多肽含量最小。 隨著底物濃度的增加， 荷葉的多肽含量隨著底物濃度的增加先增加，在底物濃度為4%時，多肽含量達到最高。 當底物濃度超過4%時，荷葉的多肽含量隨著底物濃度的增加而降低。 有可能因為酶解產物的增多對酶有抑制作用， 并且加速酶促反應的逆反應，所以多肽含量越來越小。

圖2 底物濃度對荷葉多肽含量的影響

2.2.2 酶解溫度對多肽含量的影響 根據圖3 可知，酶解溫度為45 ℃時，多肽含量最小。隨著酶解溫度的增大， 荷葉的多肽含量隨著酶解溫度的增大先增大，在酶解溫度為55 ℃時，多肽含量達到最高，當酶解溫度超過55 ℃時，荷葉的多肽含量隨著酶解溫度的增加而降低。 因堿性蛋白酶的最適溫度為40 ～55 ℃，當溫度過低時，堿性蛋白酶活性比較低，但是還沒有失活。由低溫到最適溫度的時間段里，酶的活性會隨著溫度的升高而升高，多肽含量也隨之增大。但是當溫度高于最適溫度，酶活性會隨著溫度的升高而降低， 多肽含量也隨之減少。 高于60 ℃時，堿性蛋白酶失活。

2.2.3 酶解pH 對多肽含量的影響 由圖4 可知，酶解pH 為6 時，多肽含量最小，荷葉的多肽含量隨著酶解pH 的增大先增大，在酶解pH 為9時，多肽含量達到最高，當酶解pH 超過9 時，酶活性降低，底物解離速度降低，荷葉的多肽含量隨著酶解pH 的增加而降低。 當pH 小于最適酶解pH 時，酶的活性部位的基團沒有完全解離，活性部位不能完全暴露， 酶促反應減慢， 多肽含量降低。 當pH 過高于或者過低于最適酶解pH 時，堿性蛋白酶的空間結構被破壞， 酶構象改變， 酶失活。

圖4 酶解pH 對荷葉多肽含量的影響

2.2.4 酶解時間對多肽含量的影響 根據圖5 可知，酶解時間為7 h 時，多肽含量最小。 荷葉的多肽含量隨著酶解時間的增大是先增大， 在酶解時間為5 h 時，多肽含量達到最高。當酶解時間超過5 h 時， 荷葉的多肽含量隨著酶解時間的增加而降低。 當酶解時間超過5 h 時， 由于長時間的酶解，產物增加，可能導致酶促反應的逆反應加劇，多肽含量也隨之下降。

圖5 酶解時間對荷葉多肽含量的影響

2.3 響應面試驗設計結果及分析

2.3.1 響應面試驗結果 以底物濃度、酶解溫度、酶解pH、酶解時間四個因素為自變量，多肽濃度為響應值，進行響應面試驗，確定堿性蛋白酶酶解荷葉制備多肽的最佳工藝條件。 響應面試驗結果見表3。

表3 響應面試驗結果

2.3.2 方差分析 通過Design Expert 10.0 軟件對數據進行分析， 建立多元二次響應面回歸模型為 ：R ＝8.95 ＋0.05A ＋0.019167B ＋0.1283C ＋0.04083D ＋0.01AB ＋0.015AC ＋0.02AD－0.0775BC ＋0.11BD ＋0.0275CD －0.85A2－0.40875B2－0.15C2－0.28125D2。 由表4 可知，模型F＝6.37，P ＜0.01,表明模型極顯著， 失擬項F＝3.06，P ＝0.1465 （P ＞0.05）， 說明失擬項在上述回歸模型中無顯著性，該模型的R2＝0.8643，R2adj＝0.7285， 說明該模型與試驗擬合度較好。 A2、B2表現為極顯著（P ＜0.01），說明對響應值影響極大；D2表現為顯著 （P ＜0.05），說明對響應值影響較大。 由F 檢驗可得影響因素排序為：酶解pH（C）＞底物濃度（A）＞酶解時間（D）＞酶解溫度（B）。

表4 回歸模型分析結果

2.3.3 響應面圖形分析 響應面圖直觀反映了不同因素之間的交互作用對多肽濃度的影響。 兩兩因素交互作用是否顯著與響應面圖形相關， 響應面圖形曲面越陡， 兩因素交互作用對多肽濃度的影響越大；曲面越平滑，兩因素交互作用對多肽濃度的影響越小。

觀察圖6（a）可看出，響應面圖形陡，說明酶解溫度和底物濃度的交互作用對多肽濃度影響顯著。 圖6（b）呈橢圓形，表明酶解溫度和底物濃度交互作用對多肽濃度影響顯著。

圖6 酶解溫度與底物濃度交互作用對荷葉多肽濃度影響的響應面圖

觀察圖7（a）可看出，響應面圖形陡，說明酶解pH 和底物濃度的交互作用對多肽濃度影響顯著。圖7（b）呈橢圓形，表明酶解pH 和底物濃度的交互作用對多肽濃度影響顯著。

圖7 酶解pH 與底物濃度交互作用對荷葉多肽濃度影響的響應面圖

觀察圖8（a）可看出，響應面圖形陡，說明酶解時間和底物濃度的交互作用對多肽濃度影響顯著。 圖8（b）呈橢圓形，表明酶解時間和底物濃度的交互作用對多肽濃度影響顯著。

圖8 酶解時間與底物濃度交互作用對荷葉多肽濃度影響的響應面圖

圖9（a）可看出，響應面圖形不太陡，說明酶解pH 和酶解溫度的交互作用對多肽濃度影響不顯著。圖9（b）呈近橢圓形，表明酶解pH 和酶解溫度的交互作用對多肽濃度影響不顯著。

圖9 酶解pH 和酶解溫度交互作用對荷葉多肽濃度影響的響應面圖

觀察圖10（a）可看出，響應面圖形不太陡，說明酶解時間和酶解溫度的交互作用對多肽濃度影響不顯著。 圖10（b）呈近橢圓形，表明酶解時間和酶解溫度的交互作用對多肽濃度影響不顯著。

圖10 酶解時間與酶解溫度交互作用對荷葉多肽濃度影響的響應面圖

觀察圖11（a）可看出，響應面圖形不太陡，說明酶解時間和酶解pH 的交互作用對多肽濃度影響不顯著。 圖11（b）呈近橢圓形，表明酶解時間和酶解pH 的交互作用對多肽濃度影響不顯著。

圖11 酶解時間與酶解pH 交互作用對荷葉多肽濃度影響的響應面圖

2.4 驗證酶解荷葉制備小分子多肽的優化工藝采用Design Expert 10.0 軟件做響應面優化試驗，得到制備荷葉多肽的最佳工藝條件為： 底物濃度4.07%、酶解溫度54.96 ℃、酶解pH 8.88、酶解時間5.19 h，在上述條件下，多肽濃度為8.98093 mg/mL。

3 結論

本試驗為優化利用荷葉蛋白資源， 提高荷葉的利用率， 利用超聲波輔助堿性蛋白酶酶解荷葉制備荷葉小分子多肽，再經過以底物濃度、酶解溫度、酶解pH、酶解時間四個單因素為自變量做單因素試驗。然后在單因素試驗結果的基礎上，進行響應面優化試驗， 響應面優化后得到的最佳酶解條件經過驗證， 得到荷葉多肽制備的最佳條件為底物濃度4.07%、 酶解溫度54.96 ℃、 酶解pH 8.88、酶解時間5.19 h。 在該條件下，多肽濃度為8.98×10-3mg/mL。 還得知影響多肽濃度的因素排序為：酶解pH＞底物濃度＞酶解時間＞酶解溫度。