復方中草藥四味穿心蓮益生菌發酵產物對雞大腸桿菌作用

單文琪， 江慶國， 張述陽，3， 譚艷平， 周鐵忠， 王宏軍

（1.錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001；2.大連三儀動物藥品有限公司，遼寧大連 116036；3.沈陽沈化院測試技術有限公司，遼寧沈陽 110141）

復方中草藥四味穿心蓮方劑源自《中華人民共和國獸藥典》（2020 版）二部收錄的四味穿心蓮散，由穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶4 味中草藥組成，主治仔豬、雛雞的大腸桿菌病。 汪艷秋等（2013）用高效液相色譜法（HPLC）對四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯進行含量測定， 陶松若等（2020） 研究了四味穿心蓮散及其組分對沙門菌的體外抑菌效果，姜煜倩等（2021）建立了同步檢測四味穿心蓮散中綠原酸和蘆丁的HPLC 方法，張利勃等（2023）考察了四味穿心蓮散水煎劑對禽致病性大腸桿菌的體內外抗菌活性。益生菌發酵中草藥可以促進中草藥化學成分的溶出。 研究表明，中草藥發酵產物對益生菌和動物機體都有著良好的互作關系，可以改善豬雞腸道環境，促進藥物吸收，進而提高生物利用度及其療效（陳柯源，2020）。 本試驗考察了自制復方中草藥四味穿心蓮益生菌發酵產物（FPSCS）體外抗菌活性及其對SPF 雛雞人工感染大腸桿菌病的臨床療效。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 穿心蓮、辣蓼、葫蘆茶、大青葉購自安徽亳州中草藥飲片有限公司；α-腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；硫酸新霉素、O2型雞大腸桿菌由大連三儀動物藥品有限公司提供；益生菌由臨朐一鳴飼料有限公司饋贈；復方中草藥四味穿心蓮益生菌發酵產物（FPSCS）由錦州醫科大學動物藥學實驗室提供； 恒溫培養箱購自北京金北德工公司； 雙人單面超凈工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；SPF 雞隔離器購自蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司。

1.2 藥液制備 取自制FPSCS 離心后的上清液，旋轉蒸發儀濃縮至相當于生藥1 g/mL，作為體內抗菌活性試驗藥液， 高壓滅菌后的藥液作為測定體外抗菌作用藥液。

1.3 菌懸液的制備 用徐淑云等（1994）提出的活菌計數調整細菌濃度，采用Jiang 等（2013）提出的微孔-平板法測定FPSCS 對試驗菌株的MIC和MBC，每組試驗重復3 次。

1.4 半數致死量的確定 采用改良寇氏法測定O2型雞大腸桿菌的半數致死劑量（LD50）（沈建忠，2022），按表1 分組，每只SPF 雛雞（濟南斯派福瑞生物公司） 腿肌注射0.1 mL 試驗菌液， 放入SPF 隔離器中飼養觀察 （SPF 雞所用飼料購自北京科澳協力飼料有限公司）， 記錄死亡動物數，按公式計算試驗菌株的LD50。

表1 半數致死量分組

1.5 動物試驗設計 取28 日齡健康的SPF 雛雞，以1.4 獲得的LD50腿肌注射試驗菌液制備病理模型，隨機分6 組，每組30 只，另設健康對照組，按表2 進行給藥， 觀察和記錄試驗動物的臨床表現；統計治愈率、無效率、總有效率（張瀚元，2018）。

表2 分組及給藥方法

1.6 炎癥因子的檢測 在給藥后的第2、7 天，每組隨機選取3 只雛雞頸靜脈采血2 mL，析出血清后按照ELISA 試劑盒說明書檢測樣品中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6 炎癥因子的含量。

1.7 統計分析 通過SPSS 26 版軟件對總有效率、治愈率、炎癥因子含量進行單因素方差分析，P < 0.05 表示差異顯著。

2 結果

2.1 MIC 和MBC 的測定結果 FPSCS 對O2型雞大腸桿菌體外抑菌活性結果見圖1， 其MIC 和MBC 均為31.25 mg/mL。

圖1 MIC 和MBC 的測定結果

2.2 肌內注射O2型雞大腸桿菌的LD50將表3相關數值代入LD50計算公式中，即得在SPF 雛雞腿肌注射O2型雞大腸桿菌LD50為1.94×109cfu/mL，標準誤差Sx50為0.16，95%可信限為9.42×108~4.00×109cfu/mL。

表3 SPF 雛雞腿肌注射O2 型大腸桿菌的急性毒性試驗結果

2.3 治療結果 給藥3 h 受試動物仍表現精神沉郁，6 h 受試動物排黃白色稀糞； 給藥治療2 d后，高、中、低劑量組受試動物出現明顯好轉，3 d后精神狀態良好， 采食飲水恢復正常。 各組治療效果如表4 所示，FPSCS 各劑量組間的治愈率、總有效率均無顯著性差異（P > 0.05），FPSCS 高劑量組的治愈率顯著高于硫酸新霉素組（P < 0.05），極顯著高于四味穿心蓮散組和益生菌組（P < 0.01）；FPSCS 各劑量組的總有效率均顯著性高于四味穿心蓮散組和益生菌組（P < 0.05）。

表4 各試驗組治療效果%

2.4 炎癥因子的含量 如圖2 所示， 給藥第2天，FPSCS 高、中、低劑量組血清中的IFN-γ 含量顯著高于硫酸新霉素組、四味穿心蓮散組、益生菌組和攻毒對照組（P < 0.05）， 略低于健康對照組（P ＞0.05）；FPSCS 高、中、低劑量組血清中的IL-1β 含量顯著低于四味穿心蓮散組、 硫酸新霉素組、益生菌組和攻毒對照組（P < 0.05），與健康對照組相當（P ＞0.05）；FPSCS 高、中、低劑量組血清中的IL-6 含量顯著低于四味穿心蓮散組、硫酸新霉素組、益生菌組和攻毒對照組（P < 0.05），與健康對照組相當（P ＞0.05）；FPSCS 高、中、低劑量組血清中的TNF-α 含量顯著低于四味穿心蓮散組、健康對照組、益生菌組和攻毒對照組（P < 0.05），與硫酸新霉素組相當（P ＞0.05）。 用藥后第7 天，FPSCS 高、中、低劑量組血清中的IL-6 含量顯著高于攻毒對照組（P < 0.05），FPSCS 高、中、低劑量組血清中的IFN-γ 顯著高于益生菌組、健康對照組（P < 0.05），而各試驗組血清中的IL-1β、TNFα 的含量均無顯著性差異（P ＞0.05）。

圖2 給藥第2 天和第7 天各試驗組炎癥因子含量

3 討論

微量肉湯法根據比濁度可以直觀地觀察判定藥物的抑菌作用，但是中草藥及其提取物中含有的酸性或堿性化合物可直接與營養肉湯中的蛋白發生反應而出現渾濁現象，所以單一的微量肉湯-比濁法不宜直接作為測定中草藥提取物體外抗菌活性的方法， 所以本研究選用微孔-平板法測定FPSCS 對O2型雞大腸桿菌的MIC 和MBC，避免了誤判，且抑菌效果實現可視化（如圖1 所示），此方法判定更精準與Jiang 等（2013）報道的一致。存活率、治愈率、總有效率及無效率能宏觀地反映出受試藥物對試驗群體的狀況，是評價藥物臨床應用價值的重要指標之一 （張瀚元，2018）。由表4 可知，FPSCS 高、中、低劑量組對雞大腸桿菌病的治療有效率和治愈率略高于張明悅（2022）的報道，低劑量組的治愈率高于張玥等（2021）的研究結果，由此表明，FPSCS 可以有效提高雞大腸桿菌病的治愈率和總有效率，具有一定的臨床應用價值。 由圖2 可知，FPSCS 可以顯著降低患病雛雞血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量（P < 0.05），顯著提高患病雛雞血清中抑炎因子IFN-γ 的含量（P < 0.05）。 其中TNF-α 是炎癥主要效應因子， 在介導早期炎癥過程中發揮重要作用（Hammam 等，2013）。IL-1β是促炎性細胞因子，大量的IL-1β 會引起廣泛的炎癥反應。 IL-6 具有促炎作用， 但過量的IL-6可能會誘發炎癥風暴（李東薇等，2020）。 在感染的早期，IFN-γ 具有免疫調節、 促進T 淋巴細胞增殖和分化等功能（張珂鑫，2022）。 基于此，FPSCS 能夠提高患病雛雞的免疫功能，抑制早期炎癥水平，誘發抗炎反應，維持免疫平衡，有利于保護試驗雞群平穩過渡急性攻毒期，從而治療雞大腸桿菌病。

4 結論

自制FPSCS 體外對O2型雞大腸桿菌有一定的抑菌活性，給藥劑量為0.1 ~ 0.5 g/（次·只）可以通過抑殺大腸桿菌、 抑制機體促炎因子含量而顯著降低雞群死亡率。