不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃菌群與瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

趙曉靜， 劉嫣然， 李曉輝， 張 峰， 高艷霞，左曉磊， 王曉芳， 何團(tuán)擁， 孫鳳莉 ， 張建設(shè)， 申 棟

（1.保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，河北保定 071051；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；3.正定縣南樓鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，河北正定 050800；4.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北石家莊 050000；5.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；6.石家莊市畜產(chǎn)品和獸藥飼料質(zhì)量檢測中心，河北石家莊 050041；7.石家莊市藁城區(qū)畜牧工作總站，河北藁城 052165）

飼料是奶牛生存和生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，尤其是優(yōu)質(zhì)的粗飼料，是奶牛重要的營養(yǎng)來源，對于維持奶牛瘤胃健康、提高飼喂效果和乳品質(zhì)均有重要的作用。 然而，隨著飼料原料價(jià)格的大幅度上漲，尤其是優(yōu)質(zhì)苜蓿價(jià)格居高不下，牧場經(jīng)營壓力增大。運(yùn)用動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)原理，優(yōu)化日糧設(shè)計(jì)，可減少高價(jià)苜蓿干草的用量。要達(dá)到良好的飼喂效果，必須能夠穩(wěn)定或優(yōu)化瘤胃內(nèi)環(huán)境，改善瘤胃發(fā)酵。 瘤胃是奶牛發(fā)揮生產(chǎn)性能的關(guān)鍵，瘤胃微生物與奶牛是共生關(guān)系，奶牛瘤胃為數(shù)量龐大的微生物菌群提供了理想的環(huán)境。瘤胃內(nèi)的微生物是消化植物纖維的主要貢獻(xiàn)者，其數(shù)量和種類受年齡（彭科蘭等，2019）、飼養(yǎng)方式（沈芳等，2022；楊碩等，2020）、 飼料種類、 飼喂制度 （李建國，2012）等諸多因素的影響，瘤胃內(nèi)環(huán)境與奶牛采食的日糧組成和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，改善優(yōu)化瘤胃微生物菌群可以提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)中瘤胃發(fā)酵和飼料利用的效率。

目前， 對瘤胃菌群與瘤胃發(fā)酵調(diào)控的研究主要包括甘露寡糖（郭婷婷等，2018）、低聚異麥芽糖（郭成等，2018）、果寡糖（胡丹丹等，2018）等益生元的使用，酵母培養(yǎng)物（Carpinelli 等，2021；Halfen等，2021）等益生菌（劉程等，2020）的使用及中草藥（任曼等，2022；潘龍等，2015）作為綠色添加劑的使用，此外也有一些關(guān)于發(fā)酵粗飼料的使用（謝建林等，2021）。 關(guān)于不同精粗比日糧的研究及不同飼草型日糧對瘤胃菌群影響及效果主要集中在對羊的研究上（霍俊宏等，2020），在奶牛上的研究相對較少。 燕麥干草和苜蓿干草是當(dāng)前奶牛養(yǎng)殖中兩種常用的優(yōu)質(zhì)粗飼料，在相同飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下，飼草類型不同的日糧纖維組成以及含量不同， 進(jìn)而調(diào)控瘤胃微生態(tài)環(huán)境，會(huì)引起生產(chǎn)性能的差異（程思源，2022）。因此，本研究采用三種不同粗料組成的TMR 日糧配方來飼喂泌乳中后期奶牛，以燕麥干草組合過瘤胃賴氨酸、 蛋氨酸添加劑替代部分高質(zhì)量苜蓿干草， 補(bǔ)充蛋白質(zhì)的不足， 平衡氨基酸， 探討替代方案條件下對奶牛瘤胃微生物菌群和原蟲構(gòu)成及其豐度、瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，旨在為規(guī)模化牧場實(shí)現(xiàn)低（無）苜蓿日糧的精準(zhǔn)營養(yǎng)、精細(xì)飼喂提供指導(dǎo)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選用健康的泌乳中后期荷斯坦奶牛45 頭，在牛場原有分群基礎(chǔ)上，按照產(chǎn)奶量、胎次、泌乳天數(shù)相近的原則，分為3 組，每組15 頭牛（每組15 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭牛），試驗(yàn)分組及處理見表1。

表1 試驗(yàn)分組及處理

1.2 飼養(yǎng)管理與日糧組成 飼養(yǎng)試驗(yàn)于2021 年11 月16 日至2022 年1 月18 日在河北冀豐動(dòng)物營養(yǎng)科技有限責(zé)任公司進(jìn)行，預(yù)飼期7 d，試驗(yàn)期56 d。各組奶牛采用相同的飼養(yǎng)管理模式，均采用散欄式飼養(yǎng)，每日于06:00 和18:00 兩次飼喂全混合日糧（TMR），自由采食，投料量根據(jù)剩料量調(diào)整，按采食量的105% 投料；每天推料，自由飲水；每日于06:00 和18:00 兩次擠奶。

試驗(yàn)前采集各飼料原料， 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室常規(guī)養(yǎng)分檢測，參照NRC 2001 標(biāo)準(zhǔn)配制TMR，三個(gè)試驗(yàn)組TMR 組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 各試驗(yàn)組奶牛TMR 組成及主要營養(yǎng)水平

1.3 樣品采集與測定 每組選擇奶牛5 頭，于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天晨飼前， 使用瘤胃液采樣器采集瘤胃液， 用滅菌的4 層紗布進(jìn)行過濾， 瘤胃液分為5份，1 份現(xiàn)場測定pH，使用Denver UB-7 型pH 計(jì)測定；1 份分裝于10 mL 滅菌離心管，凍存于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于瘤胃微生物菌群及原蟲的測定， 應(yīng)用16S rRNA基因測序技術(shù)測定瘤胃微生物菌群及原蟲的構(gòu)成及豐度；其余3 份也分裝于10 mL 離心管，按下列要求處理好后于-20 ℃冰箱中保存，1 份加入6 mol/L 的HCl 用于氨態(tài)氮（NH3-N）的測定，NH3-N濃度參照Weatherburn 用比色法測定；其余2 份用于微生物蛋白（MCP）及揮發(fā)性脂肪酸（VFA）(包括乙酸、丙酸、丁酸）等瘤胃發(fā)酵指標(biāo)的測定，MCP 濃度參照Makkar 等（1982）方法測定；VFA 濃度參考Erwin 等（1961）方法測定，計(jì)算總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）濃度和各VFA 的摩爾比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2000 進(jìn)行平均值及標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算， 數(shù)值用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示；再用IBM SPSS Statistics 20 軟件中分析/一般線性模型/單變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群的影響

2.1.1 門水平 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在門水平相對豐度的影響見表3。三組試驗(yàn)牛瘤胃液中檢測到的數(shù)量前10 的菌門，包括擬桿菌門、厚壁菌門、纖維桿菌門、螺旋體屬、變形菌門、SR1、Tenericutes、TM7、Verrucomicrobia、藍(lán)藻細(xì)菌。 三個(gè)試驗(yàn)組樣品中所含的細(xì)菌門主要為擬桿菌門、厚壁菌門和纖維桿菌門，均占到了總細(xì)菌的90%以上。 與苜蓿組對比，過瘤胃氨基酸組和燕麥組有提高擬桿菌門豐度的趨勢， 燕麥組厚壁菌門豐度明顯降低（P < 0.05），其他各組間差異不顯著（P > 0.05）；對藍(lán)藻細(xì)菌豐度的影響，過瘤胃氨基酸組顯著高于苜蓿組（P < 0.05），燕麥組極顯著高于苜蓿組（P < 0.01），過瘤胃氨基酸組與燕麥組差異不顯著（P > 0.05）；纖維桿菌門、螺旋體屬、 變形菌門、SR1、Tenericutes、TM7、Verrucomicrobia 和其他菌群的豐度三個(gè)試驗(yàn)組均無顯著差異（P > 0.05）。

表3 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在門水平相對豐度的影響（top10） %

2.1.2 屬水平 三組試驗(yàn)牛瘤胃液中檢測到的數(shù)量前10 的屬水平細(xì)菌相對豐度見表4。 可見，奶牛瘤胃中屬水平的細(xì)菌中普雷沃氏菌屬的豐度最高， 過瘤胃氨基酸組和燕麥組較苜蓿組有提高的趨勢，但未達(dá)顯著水平（P > 0.05）。 丁酸弧菌屬豐度苜蓿組最高，顯著高于燕麥組（P < 0.05），其他組間對比差異不顯著（P > 0.05）。 琥珀酸菌屬、纖維桿菌屬、瘤胃球菌屬、密螺旋體屬、YRC22、Coprococcus、CF231 及梭菌科-梭狀芽孢桿菌屬的豐度差異均不顯著（P > 0.05）。 除數(shù)量前10 的屬水平細(xì)菌外的其他細(xì)菌總數(shù)顯示， 苜蓿組含菌量顯著優(yōu)于燕麥組（P < 0.05），過瘤胃氨基酸組與苜蓿組和燕麥組差異均不顯著（P > 0.05）；但在細(xì)菌數(shù)量上過瘤胃氨基酸組與苜蓿組接近。

表4 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群在屬水平相對豐度的影響（top10） %

2.2 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃原蟲的影響 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃原蟲的影響見表5。 奶牛瘤胃內(nèi)原蟲主要是纖毛亞門。 結(jié)果顯示， 瘤胃內(nèi)纖毛亞門及其他原蟲豐度在三個(gè)試驗(yàn)組間均無顯著差異（P > 0.05），但過瘤胃氨基酸組較其他兩組有升高的趨勢。

表5 瘤胃原蟲分類學(xué)組成分析

2.3 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 由表6 可見， 三個(gè)試驗(yàn)組的奶牛瘤胃pH 差異不顯著（P > 0.05），均在6.50 ~ 6.70，為正常范圍。 NH3-N 濃度，過瘤胃氨基酸組和苜蓿組極顯著優(yōu)于燕麥組 （P < 0.01）；MCP 濃度苜蓿組最低，燕麥組極顯著高于苜蓿組（P < 0.01），過瘤胃氨基酸組較苜蓿組有升高的趨勢 （P >0.05）。 在TVFA 產(chǎn)量方面，過瘤胃氨基酸組極顯著優(yōu)于苜蓿組和燕麥組， 較苜蓿組和燕麥組分別增加52.71%和37.05%（P < 0.01）；在乙酸產(chǎn)量方面， 過瘤胃氨基酸組較苜蓿組和燕麥組分別增加52.32%和41.04%（P < 0.01）， 苜蓿組與燕麥組比較差異不顯著（P > 0.05）；丙酸產(chǎn)量，過瘤胃氨基酸組> 燕麥組> 苜蓿組，過瘤胃氨基酸組和燕麥組極顯著高于苜蓿組（P < 0.01），過瘤胃氨基酸組顯著高于燕麥組（P < 0.05）；丁酸產(chǎn)量方面，過瘤胃氨基酸組顯著高于苜蓿組和燕麥組（P < 0.05），苜蓿組與燕麥組無顯著差異（P > 0.05）；戊酸產(chǎn)量方面， 過瘤胃氨基酸組極顯著高于苜蓿組 （P <0.01），顯著高于燕麥組（P < 0.05），苜蓿組與燕麥組差異不顯著（P > 0.05）；異丁酸、異戊酸產(chǎn)量在各試驗(yàn)組差異均不顯著（P > 0.05）。

表6 不同日糧組成對泌乳中后期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3 討論

3.1 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃微生物菌群的影響 奶牛瘤胃寄居著大量微生物，種類甚為復(fù)雜，主要有細(xì)菌、真菌（厭氧真菌）、原蟲（纖毛蟲）三大類，瘤胃微生物對食物分解和營養(yǎng)物質(zhì)的合成起著極其重要的作用， 然而瘤胃菌群在一定程度上受到飼料種類、 飼糧組成和結(jié)構(gòu)等眾多因素的影響（Hao 等，2021）。本試驗(yàn)中奶牛瘤胃中優(yōu)勢菌門是擬桿菌門和厚壁菌門， 二者豐度占到瘤胃細(xì)菌總數(shù)的90%左右。 擬桿菌門、厚壁菌門、纖維桿菌門可降解飼料中的碳水化合物，擬桿菌門主要降解淀粉、 蛋白質(zhì)和多糖等非纖維物質(zhì)（Naas 等，2014），產(chǎn)生丙酸；厚壁菌門和纖維桿菌門促進(jìn)胃腸道對纖維素分解，產(chǎn)生乙酸（La 等，2018）。 本試驗(yàn)中，擬桿菌門豐度燕麥組> 過瘤胃氨基酸組> 苜蓿組， 此趨勢正好與日糧中NDF和FNDF 的含量趨勢一致， 日糧中NDF 和FNDF濃度與瘤胃中擬桿菌門豐度的關(guān)系， 有待進(jìn)一步研究。 瘤胃中厚壁菌門豐度苜蓿組顯著優(yōu)于燕麥組， 過瘤胃氨基酸組與苜蓿組厚壁菌門豐度差異不大， 說明過瘤胃氨基酸對奶牛瘤胃液中厚壁菌門的豐度影響不大。 纖維桿菌門的豐度燕麥組>苜蓿組> 過瘤胃氨基酸組，各組之間雖然差異不顯著，但燕麥組偏高的NDF 可能是導(dǎo)致該菌數(shù)量增加的因素，因而更有利于降解纖維，這與胡丹丹等（2018）觀點(diǎn)一致。 藍(lán)藻菌門能進(jìn)行產(chǎn)氧性光合作用，在本研究中，燕麥組豐度顯著優(yōu)于苜蓿組，過瘤胃氨基酸組與苜蓿組和燕麥組并無顯著差異， 說明偏高NDF 日糧有利于藍(lán)藻細(xì)菌的生長，這與霍俊宏等（2020）低精粗比日糧更利于藍(lán)藻細(xì)菌生長的觀點(diǎn)一致。

本試驗(yàn)中奶牛瘤胃中優(yōu)勢菌屬是普雷沃氏菌屬，祁有鵬等（2021）研究報(bào)道，普雷沃氏菌屬是肉牛瘤胃菌群中的優(yōu)勢菌屬，二者研究結(jié)果一致。該菌在本試驗(yàn)中三個(gè)試驗(yàn)組奶牛瘤胃中占到46.89%、44.31%和52.49%，其次是琥珀酸菌屬、纖維桿菌屬和瘤胃球菌屬； 其他菌屬豐度均低于2%。 普雷沃氏菌屬可分解半纖維素、蛋白質(zhì)和非纖維碳水化合物；瘤胃球菌、纖維桿菌屬和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌是重要的分解纖維素的細(xì)菌。 普雷沃氏菌屬主要發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸和琥珀酸；產(chǎn)琥珀酸擬桿菌分解纖維素產(chǎn)生琥珀酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為丙酸。由于丙酸是主要的發(fā)酵產(chǎn)物之一， 反芻動(dòng)物可由其得到葡萄糖作為能量物質(zhì)以供機(jī)體利用。 纖維分解菌可在飼料進(jìn)入瘤胃后的5 min 內(nèi)植入植物碎片的表面，日糧中有足夠氨的條件下迅速增殖，因而能夠促進(jìn)纖維粗飼料的有效利用。 丁酸弧菌屬也是奶牛瘤胃中的纖維降解菌屬， 在本試驗(yàn)中不是優(yōu)勢菌屬， 苜蓿組該菌屬豐度雖然表現(xiàn)出了優(yōu)勢，但與過瘤胃氨基酸組并無顯著差異。

3.2 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃原蟲的影響 奶牛瘤胃微生物區(qū)系及組成極為復(fù)雜，原蟲主要是纖毛亞門， 其種類和數(shù)量受瘤胃內(nèi)容物稀釋率和外流速率、 飼糧類型等多種因素的影響。王夢芝等（2009）試驗(yàn)表明，日糧結(jié)構(gòu)可改變瘤胃發(fā)酵，進(jìn)而影響原蟲種群結(jié)構(gòu)和吞噬速率。原蟲吞噬速率與日糧NDF 含量間呈三次方曲線關(guān)系，吞噬速率與細(xì)菌（原蟲）密度呈負(fù)（正）相關(guān)關(guān)系，種屬間差異顯著， 有的隨NDF 含量降低而增高，有的則相反。吐爾遜阿依·賽買提等（2018）研究表明， 高粗纖維飼糧可顯著提高塔里木馬鹿瘤胃原蟲的活力， 不同纖維水平飼糧對瘤胃原蟲總數(shù)影響不大。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在NDF 相當(dāng)?shù)臈l件下，不同粗料組成的TMR 對瘤胃內(nèi)纖毛亞門及其他原蟲組成及豐度并未造成顯著影響。 魏小蘭等（2021）分析認(rèn)為，瘤胃原蟲對奶牛營養(yǎng)物質(zhì)代謝有利有弊， 有利表現(xiàn)在纖毛蟲能夠穩(wěn)定瘤胃pH，防止瘤胃酸中毒；原蟲可利用纖維素，分解不溶性蛋白，改善蛋白品質(zhì)，降低硝酸鹽、亞硝酸鹽致毒，預(yù)防動(dòng)物中毒。 弊端在于原蟲通過吞噬細(xì)菌和真菌合成氨基酸，使微生物的氮產(chǎn)量降低；原蟲在奶牛反芻過程中與氧接觸， 原蟲的自溶代謝造成氮的無效循環(huán)；瘤胃發(fā)酵過程中增加了甲烷產(chǎn)量，加大了能量損失。楊寶鈺等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，原蟲種屬很多，數(shù)量呈凹凸形式變化，采食前奶牛瘤胃原蟲數(shù)量相對較高，采食后稀釋了胃內(nèi)容物，原蟲數(shù)量緩慢降低，新的可利用的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入瘤胃，原蟲數(shù)量又增加，維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。 可見，對瘤胃原蟲區(qū)系、種類、數(shù)量進(jìn)行合理的控制，充分發(fā)揮原蟲有利生理功能，能調(diào)控瘤胃發(fā)酵，改善生產(chǎn)性能。

3.3 不同粗料組成對泌乳中后期奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 瘤胃液pH、NH3-N 和VFA 是評價(jià)飼料在瘤胃中發(fā)酵的重要參數(shù)。 瘤胃pH 容易受到日糧性質(zhì)、采食后測定時(shí)間和環(huán)境溫度的影響，pH 穩(wěn)定在6.0 ~ 7.0， 為瘤胃發(fā)酵創(chuàng)造良好條件（李建國和高艷霞，2012）。飼料中碳水化合物以及含氮物質(zhì)的降解主要由細(xì)菌（纖維降解菌）和原蟲來完成。 本試驗(yàn)中， 各試驗(yàn)組奶牛瘤胃液pH 為6.50 ~ 6.70，在正常的范圍之內(nèi)，使纖維分解菌等微生物正常工作，可以保證良好的瘤胃發(fā)酵。

NH3-N 是利用飼料中蛋白質(zhì)、非蛋白氮合成微生物蛋白（MCP）的重要中間物質(zhì)，瘤胃內(nèi)適宜的NH3-N 濃度有利于MCP 的合成。本試驗(yàn)中，過瘤胃氨基酸組和苜蓿組奶牛瘤胃中NH3-N 濃度極顯著優(yōu)于燕麥組，而燕麥組的MCP 極顯著高于過瘤胃氨基酸組和苜蓿組，可能與燕麥組TMR 中相對較低的CP 和相對優(yōu)勢的擬桿菌門豐度有關(guān)，一方面TMR 中CP 低，瘤胃微生物分解產(chǎn)生的NH3-N 相對較少，另一方面通過優(yōu)勢擬桿菌降解淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，大大提升了MCP 的合成效率。 過瘤胃氨基酸組和苜蓿組奶牛的NH3-N 濃度差異不顯著，合成的MCP 濃度差異也不顯著，可能與這兩組TMR 中CP 稍高有關(guān)，瘤胃液中微生物將其降解為NH3-N，為瘤胃微生物提供較多的氮源。

VFA 是反芻動(dòng)物對碳水化合物消化吸收的最終產(chǎn)物， 碳水化合物在奶牛瘤胃內(nèi)被降解為單糖，再進(jìn)一步降解為VFA，包括乙酸、丙酸、丁酸等及CO2、甲烷，再被瘤胃壁吸收被機(jī)體所利用。粗飼料發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸比例較高，乙酸、丁酸是奶牛生成乳脂的主要原料； 精飼料發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸較多，丙酸比例提高，會(huì)增加體脂肪沉積（李建國，2012）。本試驗(yàn)中，在TVFA 和乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的產(chǎn)量方面， 過瘤胃氨基酸組均表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢，為奶牛提供更多能量。

4 結(jié)論

綜上所述， 各試驗(yàn)組奶牛瘤胃液pH 穩(wěn)定在正常范圍之內(nèi)，有利于瘤胃發(fā)酵。在門水平和屬水平，三個(gè)試驗(yàn)組優(yōu)勢菌群的組成相同，只是菌的占比稍有差異， 過瘤胃氨基酸組和苜蓿組的優(yōu)勢菌群的相對豐度均優(yōu)于燕麥組， 過瘤胃氨基酸組和苜蓿組的優(yōu)勢菌群差異不顯著。在TVFA 和乙酸、丙酸、丁酸、戊酸的產(chǎn)量方面，過瘤胃氨基酸組均表現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢。

在本試驗(yàn)條件下，綜合評定認(rèn)為，以燕麥干草組合過瘤胃賴氨酸、 蛋氨酸添加劑替代部分高質(zhì)量苜蓿干草的TMR 日糧飼喂泌乳中后期奶牛，穩(wěn)定了瘤胃菌群和瘤胃發(fā)酵微生態(tài)環(huán)境， 適當(dāng)降低了干草質(zhì)量， 用過瘤胃賴氨酸和蛋氨酸補(bǔ)充了蛋白質(zhì)的不足，可以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。