色譜理論課程教學與應用實例解析

趙志燊,趙 杰,余 磊

(貴陽學院 貴州生態環境中優勢農產品殘留農藥降解關鍵技術研究重點實驗室,貴州 貴陽 550005)

儀器分析一直以來是高校化學實驗課程中最為重要的課程之一。它幾乎涵蓋了環境檢測、食品品質與安全、材料合成與應用等基礎理論化學和應用化學中相關分析儀器使用的基礎理論。[1-4]其所含涵蓋的色譜學、光譜學與電化學的技術在近年來突飛猛進。隨著國家經濟與社會的不斷發展,相關行業分析標準對設備的要求也越來越高,包括逐漸提高準入門檻的資質要求等,這無一不體現出該門課程需要與時俱進的重要性。[5]這不僅需要課程在注重“教”的同時更加注重實踐教學。操作實驗中,結合學生提出疑問、反饋難點,對應重點相結合,歸納出存在難點的實例操作與講解,科學地開展“教練結合”,打破傳統PPT理論或實驗視頻教學。模式則主要概括為通過講解—實驗—歸納,使學生明顯感受儀器操作與理論并重的重要性,并在操作實例中解決理論難點的理解問題。

對此,以色譜理論為例,結合氣相色譜與液相色譜不同檢測器的分析特點,并應用實際操作實例上樣分析。學生在實際讀取譜圖中與理論相結合,加深對基礎理論記憶的同時,并對理論難點進行梳理與運用,解決僅僅通過解題鞏固知識的傳統教學帶來的弊端。在具體到色譜檢測器對應的難點上存在同樣的問題,且在相關研究中均有不同程度體現。譚芳在氣相色譜實驗課程教學里,論證了實驗課程中改變氣相色譜儀檢測器、色譜柱的升溫程序等條件來讓學生操作,并記錄在實驗報告上,更好地優化色譜條件,充分地理解理論知識。[6]吳澤穎等在色譜教學研究中,發現學生學習色譜知識的主動性、實踐能力不高,需要與實際應用如與企業合作教學等方法結合,打破傳統老師僅僅教、學生學的模式,提升教學質量。[7]孫艷濤等則在傳統氣相色譜儀器操作實驗中,僅對填充色譜柱與檢測器的靈敏度與其他性能進行測定的基礎上進行改進;引入作為汽油重要組分二甲苯的3種同分異構體作為實驗的目標化合物,3種化合物的物化性質相近,一般的物理與化學方法難以分離鑒定,從而利于學生更好地理解氣相色譜儀分析優勢與提升儀器分析條件變化的能力。[8]賈瓊等就在其儀器分析實驗課程設計的相關研究中,指出傳統儀器分析實驗針對儀器操作的學習較為單一,綜合性不強。[9]劉莎莎等則充分利用自己測定野菊花中的龍腦和樟腦的科研成果轉化并應用到氣相色譜的實驗教學,學生自行選擇實驗條件并優化,分組討論影響因素,在教研結合的情況下,充分激勵學生的學習與科研熱情,取得更好的教學效果。[10]通過匯總以上儀器分析中色譜單元應用教學中的難點,不難發現普遍存在理論與實踐應用脫節這樣的“通病”。

1 學生反映教學難點歸納

結合儀器分析課程班級49名學生,其中男生24名,女生25名,對色譜理論教學色譜理論與檢測器構造中存在的難點進行匯總,見表1。表1顯示,塔板理論是較多知識點中,反饋人數最多的一點。學生對該知識點的理解較難在于以下兩個方面：一是色譜柱在實際的應用中,并不存在塔板,它只是為了表達柱效中的分離效果而引入的概念;二是因為塔板理論在邏輯過程中,對數學的運算能力有一定要求,需要學生具有良好的數學基礎。在缺乏實例的情況下,不利于對該理論的理解。在速率理論與分離度知識點上,學生則更為突出反映的是在理解該知識點后,缺乏實例的補充,若僅從書上的附圖與相應公式解釋,則理解較為空洞。

表1 教學難點匯總

2 教研結合的應用實例

鑒于上述統計,并結合儀器分析實驗課程現有的弊端與改革取得的效果。在對應氣相色譜理論與運用教學中,筆者采用教研結合的方式,對環境分析中普遍存在的典型持久性有機污染物,包括美國環保署優先控制的16種多環芳烴以及21種典型有機氯農藥,作為教學目標化合物,通過不同的升溫程序、檢測器、不同基質,作為結果比較與討論的優化項目。打破傳統單一固定的較少化合物實驗模式,總結并綜合全面的教研結合課程模式。16種多環芳烴與21種有機氯農藥見表2所示。

表2 應用于教學的16種多環芳烴與21種有機氯農藥

對于烴類物質,在氣相色譜教學設計中,主要應用氫火焰離子化檢測器(Flame Ionization Detector,FID)來進行檢測,但對于某些同分異構體,其物化性質非常接近,則難以分離。在此基礎上,引入液相色譜儀(Liquid chromatograph,LC)、質譜檢測器(Mass Spectrometry,MS)檢測。介紹LC相對于GC的不同,MS相對于FID的優勢。對典型有機氯農藥采用電子捕獲檢測器(Electron Capture Detector,ECD)檢測,對其在綠茶基質提取液中出現峰漂移現象,介紹出現故障的可能原因與維修方法。

圖1為16種多環芳烴以正己烷為溶劑的標準品,苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽截取色譜圖。使用FID檢測出峰時間段的升溫速率分別為2.5 ℃/min、1 ℃/min和0.5 ℃/min,以代表常規、較慢與慢速3種不同升溫速率所得色譜圖。運用在教學中,講解升溫速率對分離效果影響的理論。但鑒于在大量教學理論與案例中已有講解,此處以升溫速率改變對同分異構化合物分離效果影響較小的特例介紹,同時比較其他檢測器與不同色譜檢測模式優劣性,做到教學難點重點結合與模式創新。

氣相色譜儀升溫過程中采用島津GC-2014C色譜儀,配備FID,載氣為氮氣,色譜柱采用美國安捷倫型號DB-5,規格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。常規升溫速率程序為：“氣化室溫度250 ℃,檢測器溫度300 ℃;色譜柱初始溫度為80 ℃,以15 ℃/min的升溫速率,達245 ℃;以10 ℃/min的速率升溫到255 ℃并保留1min;再以1 ℃/min的速率升溫到265 ℃并保留1min,最后以2.5 ℃/min升高到295 ℃并保留2min”。圖1A顯示同分異構體苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽難以有效分離。此時的苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽出峰時間處于色譜柱以2.5 ℃/min升高到295 ℃的時間段內,色譜柱升溫到270 ℃以上后,開始出峰。為達到符合要求的分離效果,將對應出峰時間段的升溫速率降低,在之前方法基礎上,270 ℃～280 ℃升溫段內,采用1 ℃/min的較慢升溫速率,出峰結果見圖1B。圖1B顯示,在改變升溫速率后,苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽依舊難以有效分離,不能定性與定量分析。最后,采用0.5 ℃/min的慢速升溫速率,出峰結果見圖1C。圖1C分離效果甚至低于圖1B,有出現3個色譜峰重疊的可能,仍不能滿足定性與定量的要求。

圖1A 常規升溫速率苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽氣相色譜圖

圖1B 較慢升溫速率苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽氣相色譜圖

圖1C 慢速升溫速率苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽氣相色譜圖

氣相色譜儀升溫速率對分離度影響的理論中,升溫速率在恒壓控制下,與載氣在柱中流速的比值與分離度成反比。[12]上述案例驗證,載氣流速相同條件下,降低升溫速率,比值變小,則分離度應該增大。但對于某些特殊的同分異構體,如苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽依舊難以顯著改善分離度,以達到定性與定量的要求。該實例所得的色譜圖與張茂升等的研究中存在同等化合物不能有效分離的現象,結論一致。[11]對此,引入采用液相色譜儀配備紫外檢測器對應16種PAHs的檢測,從而比較兩者之間的不同之處。LC與GC的不同之處在于具有高沸點、大分子,熱穩定性差的化合物,LC比GC更合適。苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽對應沸點分別為481 ℃與480 ℃,均高于300 ℃。采用液相色譜儀檢測多環芳烴,二極管陣列串聯熒光檢測器、紫外檢測器均可檢測,此處介紹2種檢測器的原理與不同之處。在實例中,以島津LC-16配備紫外檢測器,色譜柱采用C18反相分析柱,型號：Athena PAHs HPLC Column,規格：25 cm×4.6 mm×5 μm,以乙腈與超純水作為流動相進行檢測。對應16種PAHs中苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽截取色譜圖譜見圖2。圖2顯示2種化合物的分離效果明顯優于氣相色譜分析法,雖然仍有連峰現象,但總體分離效果較好,分離度達到基本定性與定量要求。

圖2 苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽液相色譜圖

苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽的特殊性在比較兩種不同色譜分析模式的優劣后,更深一步地引入質譜分析原理及聯用優勢。在此基礎上,引入總離子流色譜圖、離子峰、電子電離源等概念。電子電離源在固定70 V電壓的條件下,對化合物建立的標準譜庫,更有利于化合物的分析與檢索。該實例中,以美國安捷倫型號為8890-7000D,氣相色譜三重四級桿質譜儀,采用單四級桿模式,色譜柱為美國安捷倫型號：DB-5MS,規格：30 m×0.25 mm×0.25 μm。圖3A為苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽的總離子流色譜圖,其分離度較GC-FID有所提高,但并不優于LC的分離度。但此處因為有了譜庫可作為參比依據,以不同化合物的質譜圖作為定性依據,則相對于單色譜而言,更加復雜基質的提取液分析也提供了更為精準的保證。圖3B與3C分別為苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽的質譜圖。在兩張質譜圖的差異中,更好地定性苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽。

圖3A 苯并(b)熒蒽與苯并(k)熒蒽總離子流色譜圖

圖3B 苯并(b)熒蒽質譜圖

圖3C 苯并(k)熒蒽質譜圖

在教研結合的教學中,還有一個重要環節,針對儀器操作中出現的故障,進行實例講解。此處引入色譜實驗教學實例中色譜峰漂移的原因,包括載氣受到波動,引起流速變化;長時間進樣引起色譜柱污染與載氣被污染等因素并有效結合理論進行闡述。設備采用島津GC-2014C配備ECD,色譜柱采用美國安捷倫型號DB-1701,規格為30 m×0.25mm×0.25 μm。對應21種有機氯農藥標準樣品,在綠茶基質提取液中的色譜圖與純標準品的對比色譜圖見圖4。圖4A為21種有機氯農藥標準溶液色譜圖,圖4B為進樣兩周后,色譜柱接進樣口端受到污染,發生基質提取液出峰滯后漂移現象,不利于準確定性。通過陶瓷切割片,切割受污染部分色譜柱,截取長度為20 cm;并以300 ℃老化色譜柱4 h。圖4C中為截取受污染色譜柱,并老化后的色譜對比圖。此時,21種有機氯農藥綠茶基質提取液與純有機氯農藥標準品對應出峰時間重疊圖,未發生峰漂移現象,可用于定性定量。

圖4A 21種有機氯農藥標準溶液氣相色譜圖

圖4B 受污染色譜柱21種有機氯農藥對比色譜圖 (注：黑線為標準色譜峰,藍線為綠茶基質提取液。)

圖4C 干凈色譜柱21種有機氯農藥對比色譜圖 (注：黑線為標準色譜峰,紅線為綠茶基質提取液。)

3 結論

通過對16種多環芳烴的不同檢測,對色譜理論、方式與檢測器類型的實例講解,并對21種有機氯農藥在綠茶基質檢測過程中出現峰漂移現象所產生的故障原因進行分析與溯源。存在相關知識點疑惑的學生人數由講解與操作之前的8-12人降至3-5人,對教學成果的優化率顯著提高。