連續配施有機肥對茶園土壤細菌群落結構及功能類群的影響

關鍵詞：茶園土壤；有機肥配施化肥；細菌多樣性；細菌群落結構；細菌功能類群

中圖分類號：S154.3；S571.1 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2959-15 doi：10.11654/jaes.2023-1067

茶樹是典型葉用經濟作物，一年中新梢的多輪次采摘會帶走大量養分，因而比其他農作物對養分的需求量更大。茶農為了提高茶葉產量，大量化肥被施入茶園土壤，為茶樹生長補充大量速效養分，迅速提升茶葉產量[1-2]。據國家茶產業技術體系調查數據顯示[3]，全國茶園化肥養分平均用量為678 kg·hm^-2（高施肥茶園化肥用量可達1 041 kg·hm^-2），提供茶樹全年90%的氮、78%的磷和75%的鉀，茶園化肥過量施用比例超過30%，且施肥主要以復合肥、尿素等速效化肥為主。長期過量施用化肥導致茶園土壤出現酸化程度加劇、板結和透氣性差、養分不均衡退化、微生物多樣性及功能下降等一系列問題[4-5]，過量化肥還會以淋洗、地表徑流、氨揮發及N₂O排放等形式進入環境[6-7]，造成肥料浪費和環境污染。有機肥配施化肥是茶園化肥減施的重要途徑，可有效緩解茶園單施化肥引起的土壤質量下降問題[8]，且能夠明顯提高茶葉品質。有研究表明，有機肥替代部分化肥可顯著提高茶園土壤有機質和養分含量，提高土壤酶活性，降低養分徑流損失，改善土壤結構，提高茶葉產量和品質，同時降低茶園土壤溫室氣體排放量[9-11]。但連續施用有機肥對土壤微生物群落的影響仍有待明確。

土壤微生物是生態系統的重要組成部分，幾乎參與了所有生態系統中土壤、碳、氮、磷、硫、鐵等養分的生物地球化學循環過程[12]，是表征生態系統健康和恢復水平的敏感性指標[13]。有研究表明，在地球的各個生物群落中，土壤微生物群落結構及多樣性與一系列的生態系統功能，如營養循環、分解和植物生產力有正相關[14]，且能夠迅速響應土壤環境的變化。施肥作為一項重要的農業措施，會加速土壤退化進程，對土壤微生物群落結構和功能組成產生影響。近年來的研究表明，長期單施化肥會引起土壤酸化，導致微生物多樣性降低[15-16]，與單施化肥相比，合理配施有機肥可以提高土壤微生物多樣性和多功能性[17-18]，從而減少集約施肥的負面效應。然而一些研究者發現施用有機肥后土壤微生物多樣性并未發生明顯改變，甚至會降低土壤微生物群落的多樣性，這些不一致的結果可能是由有機肥類型和施肥持續年限不同造成的[19-21]，且土壤類型和土地利用方式也可能影響有機肥對土壤微生物多樣性和群落組成的影響[22]。在茶園生態系統中，茶園施肥管理措施通過改變土壤理化性質直接影響土壤微生物數量和群落，或影響茶樹根系分泌物（分泌物種類和數量）間接對土壤微生物數量和群落產生影響[23]。田間試驗結果表明，長期施用氮肥改變了茶園土壤細菌群落特征，群落多樣性和穩定性下降導致有益菌群減少[24-25]。相反，茶園施用有機肥能提高土壤細菌的多樣性，還能有效調節茶園土壤細菌群落結構，改善潛在的生態系統功能[26-27]，但是過高的有機肥替代比例會降低茶葉產量[28]。相比而言，微生物各物種間的網絡互作關系及功能多樣性對于預測土壤生態功能更有意義，但有關施肥對茶園土壤細菌網絡及功能影響的研究尚少見報道。因此，本研究基于6 a 的茶園長期定位試驗，采用IlluminaMiSeq高通量測序技術和共現性網絡分析，探討不同施肥措施下茶園土壤細菌群落多樣性、群落組成和共線性網絡的變化趨勢，并利用FAPROTAX方法對土壤細菌生態功能進行預測，以期為茶園合理施肥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于福建省壽寧縣南陽鎮龜嶺村的茶園長期定位試驗基地（27°43′N，119°40′E），該區域處于亞熱帶季風氣候區，海拔高度657 m，全年平均氣溫為15.1 ℃，低溫出現在1月，平均為3.7 ℃，高溫出現在7月，平均為22.6 ℃，年平均降雨量為1831mm。試驗地土壤的成土母質為火山巖，土壤類型為紅壤。試驗地植茶前土壤（0～20 cm）基礎理化性質如下：pH5.57，有機質4.49 g·kg^-1，全氮0.20 g·kg^-1，堿解氮25.1mg·kg^-1，全磷0.11 g·kg^-1，有效磷0.80 mg·kg^-1，全鉀7.65 g·kg^-1，速效鉀31.9 mg·kg^-1。

1.2 試驗設計

長期定位試驗設計如下：2016 年選擇未種植過茶樹的自然土壤布置長期定位試驗，用單片磚水泥全粉刷的方式進行小區的分割，分割處深入地下30 cm，并涂防水材料處理，地面上高出20 cm。采用隨機區組方法進行排列，每個區組之間距離30 cm，中間有水泥排水溝，每個小區留有統一方向的出水口通向排水溝（圖1）。2016年冬季將試驗小區進行土地平整，于2016年11月24日種植1年生扦插苗，茶樹品種為金牡丹（C. sinensis cv. jinmudan）。具體施肥處理如下：①對照（CK），植茶不施肥；②單施化肥（CF），施用量以純氮計算，第1年為75 kg·hm^-2，第2年為150 kg·hm^-2，第3年為300 kg·hm^-2，第4年為450 kg·hm^-2，此后每年均為600 kg·hm^-2；③單施化肥+清園處理（CFC），茶園管理以清耕除草為主，茶樹修剪時移除修剪枝條；④有機肥配施化肥（OF），第1年和第2年有機肥的施用量為化肥等氮量的50%，第3年起有機肥的施用量改為化肥等氮量的25%；⑤有機肥配施化肥+種植綠肥（OFM），日常種植綠肥，綠肥品種為白三葉。每個處理設4個重復，小區面積為30 m²。尿素（含氮量46%）、過磷酸鈣（含磷量12%）和硫酸鉀（含鉀量52%）作為化肥養分來源，肥料養分配比N∶P₂O₅∶K₂O=1∶0.33∶0.48，施肥方式為撒施。氮肥和鉀肥分批次施用，冬季基肥40%（11月下旬）、春季催芽肥30%（3中下旬—4月上旬），秋茶追肥30%（8月中下旬），有機肥和磷肥作為基肥一次性施入。有機肥來源為商品有機肥（N 4.3%、P₂O₅ 1.1%、K₂O 3.2%），茶行中間開15～20cm 的施肥溝，溝施覆土。采摘按照制作大宗紅茶標準（一芽二葉或一芽三葉）進行，春茶和秋茶各采摘一次。修剪按照傳統方式進行，各處理保持一致。

1.3 土壤樣品采集與處理

各試驗小區土壤樣品采集于2022 年6 月，去除地表的凋落物后，按照隨機多點混合取樣，采集耕層0～30 cm土壤樣品，采集5點子樣點混合成1個樣品，共獲得20份樣品，樣品用冰盒運輸帶回實驗室。剔除植物殘體、石塊等雜物，樣品分成兩份：一份保存于-80 ℃冰箱用于土壤微生物測定；另一份置于室內通風場地晾干，用木棍碾碎分別過10、20 目和100 目的標準篩后裝袋，標記好用于土壤理化性質測定。

1.5 土壤微生物DNA提取與高通量測序

采用FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒（MP Bio?medicals，美國）提取土壤微生物DNA，提取過程參照說明書進行。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品質量，用NanoDrop2000 超微量分光光度計檢驗DNA 的濃度和純度，稀釋合格后的樣品保存于-80 ℃冰箱用于PCR擴增。細菌選用16S通用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）進行擴增。擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45s，27個循環；72 ℃延伸10 min直至反應完成。擴增體系為20 μL 反應體系，其中包括4 μL 的5×FastPfuBuffer緩沖液、2 μL 的2.5 mmol·L^-1 dNTPs、0.8 μL 的正反引物（5 μmol·L^-1）、0.4 μL的5×FastPfu DNA聚合酶、0.2 μL 的BSA 和10 ng 的模板DNA，補dd H₂O 至20 μL。擴增產物委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序工作，測序平臺為Illumina MiSeq（PE300，San Diego，CA，美國）。

1.6 數據處理與統計分析

測序獲得的原始序列經過Qiime 平臺篩選和序列優化后，依據97%的相似度聚類成操作分類單元，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97% 相似水平的OTU代表序列進行分類學信息注釋。細菌16S rRNA比對數據庫為Silva（Release138 http：//www.arb-silva.de），默認置信度閾值為0.7。20 個土壤樣品獲得1 756 713條高質量的序列，平均長度為414.14 bp，可劃分為40個門，134個綱，327個目，515個科，991個屬，2144 個種。采用Mothur（1.30.2）計算樣品的Alpha多樣性指數來反映微生物群落的豐富度（Sobs、Chao1、Ace）和多樣性（Shannon、Simpson）。采用Qiime（2020.2.0）計算beta 多樣性Bray-Curtis 距離矩陣。R語言（version 3.3.1）vegan軟件包進行非度量多維尺度分析（NMDS分析）和制圖，可視化呈現不同環境樣本中群落組成的相似或差異程度。土壤細菌功能預測采用FAPROTAX 軟件[30]，具體分析步驟基于美吉在線云平臺（https：//cloud.majorbio.com/）?；跇颖綩TU 之間的Spearman 系數進行共現性網絡分析，保留穩健相關（相關系數絕對值gt;0.7，Plt;0.05）的OTU進行構建，將單施化肥（CF、CFC）和有機肥配施化肥（OF、OFM）的處理進行合并，從而提高網絡的穩健性和可信度。利用Networkx復雜網絡分析工具包（Python語言），通過計算網絡的節點度分布、網絡的直徑、網絡的平均最短路徑，以及節點聯通性、緊密系數、介數中心性等屬性，來獲得物種和樣本的組內或組間的相關信息，更加全面高效地挖掘出復雜數據中包含的信息。利用Cytoscape 3.8.2 軟件對微生物網絡進行可視化處理，為方便構圖挑選豐度前50位的物種進行展示。土壤細菌群落結構與土壤理化性質之間的相關性采用冗余分析（RDA 分析），采用R語言vegan 包進行分析和制圖。RDA 分析前對環境因子進行篩選，采用方差膨脹因子分析保留多重共線性較小的環境因子（VIFlt;10）進行后續研究。采用Spearman相關系數進行環境因子與物種之間的相關性熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同施肥措施對茶園土壤理化性質的影響

不同施肥處理下，茶園土壤理化性質產生了明顯的變化（表1）。由于持續的養分投入，相比CK處理，各施肥處理的土壤養分含量均有所增加（土壤全鉀除外）。統計分析表明，與CK處理相比，CF處理使土壤堿解氮和全磷含量（Plt;0.05）分別顯著增加了27.47%和32.70%，其他指標差異不顯著（Pgt;0.05）；與CK處理相比，OF 和OFM 處理土壤pH 分別顯著增加0.85 個和0.32個單位（Plt;0.05），土壤全氮、堿解氮、全磷及速效磷含量顯著增加（Plt;0.05）；與CF 處理相比，OF 處理顯著增加了土壤pH、全磷、速效磷和速效鉀（Plt;0.05），OFM處理顯著增加了土壤pH（Plt;0.05）；CF和CFC 處理之間土壤理化性質差異不顯著（Pgt;0.05）。由此可見，連續6a配施有機肥提高了茶園土壤有機質、全氮、速效養分含量和pH，改善了茶園土壤肥力水平。

2.2 不同施肥措施對土壤細菌群落Alpha多樣性的影響

不同施肥處理茶園土壤樣品中一共分析出26 973個OTUs數目，其中各施肥處理土壤共有OTUs數為2733個，占OTUs總數的10.13%（圖2）。CK、CF、CFC、OF 和OFM 土壤細菌OTUs 總數分別為5 282、4935、5068、5 611個和6077個，單施化肥處理OTUs數目低于CK，而有機肥配施處理OTUs數目明顯高于單施化肥處理。

通過分析土壤樣品，計算得到各樣品土壤細菌Alpha多樣性指數（表2）。由表2可知，覆蓋度指數值在所有的處理中均大于97.7%，表明在該測序深度下，大多數的細菌群落已經被覆蓋。不同施肥處理下Sobs指數為2 897.81～3 602.81、Ace指數為3 882.40～4 676.10，Chao1指數為3 890.30～4 653.30，Shannon指數為6.37～6.73，Simpson 指數為0.003 6～0.005 5。與CK處理相比，CF和CFC處理降低土壤細菌群落Alpha多樣性指數，但差異不顯著（Pgt;0.05），OFM處理顯著增加了土壤細菌Sobs、Ace、Chao1和Shannon指數（Plt;0.05），顯著降低了Simpson 指數（Plt;0.05）；OFM 處理的Sobs、Ace、Chao1 和Shannon 指數顯著高于CF 和CFC處理（Plt;0.05），OF和OFM處理之間各指數差異不顯著（Pgt;0.05）。整體上，單施化肥處理一定程度降低土壤細菌群落的多樣性指數，而配施有機肥則提高土壤細菌群落的多樣性。

2.3 不同施肥措施對土壤細菌群落特征和Beta多樣性的影響

各處理土壤細菌門水平相對豐度如圖3a所示，豐度相對較高（gt;1%）的有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacterita）、酸桿菌門（Acidobacteria）綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、黏球菌門（Myxococcota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、浮霉菌門（Planctomycetota）和WPS-2候選分支，其中綠彎菌門、放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是絕對優勢菌門，約占到所有細菌總數的72.67%～77.31%。與CK處理相比，OF處理顯著增加了厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度（Plt;0.05）；與CF和CFC處理相比，OF處理顯著增加了黏球菌門的相對豐度（Plt;0.05），但也顯著降低了浮霉菌門的相對豐度（Plt;0.05）。

在屬分類水平上（圖3b），相對豐度大于1%的屬共有26 個，其中norank_f__norank_o__norank_c__AD3、norank_f__Xanthobacteraceae、norank_f__norank_o__Subgroup_2、norank_f__norank_o__Acidobacteriales 和norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 的相對豐度大于5%。與CK處理相比，OF和OFM處理顯著降低了norank_f__norank_o__norank_c__AD3 和熱酸菌屬（Acidothermus）的相對豐度（Plt;0.05），OF處理顯著增加了芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度（Plt;0.05）；與CF 處理相比，OFM 處理顯著增加了norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 的相對豐度，OF 和OFM處理顯著降低了熱酸菌屬、羅河桿菌屬（Rhodano?bacter）和Burkholderia - Caballeronia-Paraburkholderia的相對豐度（Plt;0.05），OF處理顯著增加了芽孢桿菌屬的相對豐度（Plt;0.05）。

對不同施肥措施的茶園土壤細菌群落進行NMDS分析，結果見圖4。從圖4可以看出，單施化肥的CF和CFC兩個處理的土壤樣品較為緊密地聚集在一起，CK和CFC處理之間也有一定程度的重合，而施用有機肥（OF和OFM）處理土壤細菌群落結構與施用化肥（CF和CFC）均有明顯差異。進一步通過ANOSIM分析表明，不同施肥措施顯著改變茶園土壤細菌群落結構（R²=0.442 1，P=0.001）。OF 與CK、CF 和CFC 處理之間的細菌群落結構存在顯著差異（Plt;0.05），OFM 與CFC 處理之間的細菌群落結構存在顯著差異（Plt;0.05），其他處理之間差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 不同施肥措施對茶園土壤細菌功能菌群的影響

采用FAPROTAX工具對土壤細菌群落功能注釋后共獲得45種功能分組，相對豐度較高的功能類群如圖5 所示。各處理中化能異養（chemoheterotro?phy）、有氧化能異養（aerobic chemoheterotrophy）、固氮作用（nitrogen fixation）、纖維素分解（cellulolysis）、硝酸鹽還原作用（nitrate reduction）、發酵作用（fer?mentation）、鐵呼吸（iron respiration）、尿素水解（ureol?ysis）和光養作用（phototrophy）的相對豐度在1% 以上，其中化能異養、有氧化能異養、固氮作用、纖維素分解和硝酸鹽還原作用功能類群占總豐度的65.63%～76.28%。方差分析結果表明，與CK 處理相比，CF處理中捕食性或外寄生作用（predatory or exo?parasitic）功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），而錳氧化作用（manganese oxidation）功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05），OF和OFM處理中固氮作用和纖維素分解功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），芳香族化合物降解（aromatic compound degradation）功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05）。與CF處理相比，OF處理中纖維素分解和錳氧化作用功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），捕食性或外寄生作用、光異養作用（photoheterotrophy）、光養作用（pho?totrophy）、氮呼吸（nitrogen respiration）、硝酸鹽呼吸（nitrate respiration）、亞硝酸鹽呼吸（nitrite respira?tion）、硝酸鹽反硝化（nitrate denitrification）、亞硝酸反硝化（nitrite denitrification）、一氧化二氮反硝化（nitrous-oxide-denitrification）、反硝化作用（denitrifi?cation）、光合自養硫氧化（anoxygenic photoautotrophy Soxidizing）和光能自養（anoxygenic photoautotrophy）功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05）。

2.5 不同施肥措施對茶園土壤細菌共現性網絡特征的影響

基于CK、單施化肥（CF、CFC）、有機肥配施化肥（OF、OFM）測序結果構建細菌共現性網絡（圖6、表3）。如圖6和表3所示，3個處理的共現性網絡具有明顯的不同，CK處理網絡由48個節點和234條邊組成，菌群主要分布在變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門和GLA15；單施化肥網絡有48個節點和292條邊組成，菌群主要分布在變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門；有機肥配施網絡由48個節點和258條邊組成，菌群主要分布在藍藻門（Cyanobacteria）、芽單胞菌門、變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門和酸桿菌門。與CK 處理相比，單施化肥土壤細菌分子網絡平均連通度明顯增加，表明施肥后其網絡規模、復雜性均得到了提升，其中單施化肥處理的邊數、連通度大于有機肥配施處理。各處理細菌作用均以正相關為主（正相關比例為58.03%～77.78%），說明各處理細菌均以合作關系為主，其中正相關比例排序為CKgt;單施化肥gt;有機肥配施，施肥加劇了茶園土壤細菌間的競爭程度。相比CK處理，單施化肥和有機肥配施處理下的網絡平均聚類系數較低，而網絡平均路徑長度距離較長。

2.6 土壤細菌多樣性及群落結構與土壤理化性質的相關性

土壤理化性質和土壤細菌多樣性的相關性分析見圖7，土壤pH、全磷和速效磷與土壤細菌Sobs、Shannon、Ace和Chao1指數呈顯著或極顯著正相關，與Simpson指數呈顯著或極顯著負相關；其余指標與土壤細菌多樣性指數之間的相關性均未達到顯著水平。總體而言，土壤pH、全磷和速效磷對土壤細菌群落多樣性影響較為顯著。

土壤理化性質與相對豐度最高的12個門和50個屬的Spearman相關性分析結果見圖8。門水平上（圖8a），土壤pH與放線菌門、厚壁菌門、黏球菌門和芽單胞菌門的相對豐度之間呈顯著或極顯著正相關，與浮霉菌門的相對豐度呈極顯著負相關；土壤全磷和速效磷與放線菌門、厚壁菌門、黏球菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度呈顯著或極顯著正相關，與綠彎菌門、浮霉菌門和WPS-2的相對豐度呈顯著或極顯著負相關；土壤速效鉀與擬桿菌門的相對豐度呈顯著正相關。在屬水平上（圖8b），土壤有機質、全氮、速效鉀和CEC與大多數土壤細菌屬的相對豐度相關性不顯著，土壤pH、全磷和速效磷與大多數細菌屬的相對豐度存在顯著或極顯著相關性。

進一步通過RDA分析來解析土壤理化性質對細菌群落結構的影響。結果（圖9a）顯示，門水平上土壤理化性質解釋了細菌群落結構變化的58.47%，其中第一排序軸解釋量為46.88%，第二排序軸解釋量為11.59%，其中速效磷（R²=0.841 9，P=0.001）和pH（R²=0.6309，P=0.001）對土壤細菌群落結構的影響顯著。在屬水平上（圖9b），前兩個排序軸分別解釋了細菌群落變化的46.91% 和11.21%，兩者共解釋58.12%，速效磷（R²=0.676 7，P=0.001）和pH（R²=0.4938，P=0.004）對土壤細菌群落結構有顯著影響。由Mantel test（表4）分析可知，有效磷和pH對土壤細菌群落結構（門水平）具有最顯著的影響（R=0.4346，P=0.002 和R=0.3087，P=0.003），有效磷對土壤細菌群落結構（屬水平）具有最顯著的影響（R=0.2339，P=0.026）。因此，土壤有效磷和土壤pH可能是影響施肥后茶園土壤細菌群落變化的重要環境因素。

3 討論

3.1 不同施肥措施對茶園土壤細菌多樣性和群落組成的影響

適宜的有機肥替代比例不僅提高茶葉產量[31]，增加茶葉水浸出物、氨基酸和香氣成分物質的含量，還可以改善茶園土壤理化性狀，并引起土壤微生物群落結構及多樣性的差異[32-33]。土壤細菌Alpha多樣性指數是表征土壤細菌功能和生態系統穩定的重要指標，一般而言長期施用化肥導致土壤酸化和養分不均衡，降低土壤細菌多樣性[15]，而施用有機肥則會刺激土壤細菌生長并提高土壤細菌多樣性[17-18]。Feng等[34]分析了我國10個20 a田間施肥（有機肥和無機肥）試驗結果，發現在高降水和高土壤肥力地區的酸性土壤中，施用化肥可導致土壤進一步酸化，進而對土壤細菌多樣性產生負面影響，而有機肥能提高大多數酸性土壤細菌豐富度。本研究中，與CK處理相比，6 a CF處理降低茶園土壤細菌群落的多樣性指數，而OF處理和OFM處理均提高了細菌Alpha多樣性指數，其中OFM處理細菌Alpha多樣性指數顯著增加（表2）。Ma等[24]對龍井茶園研究的結果也與本研究一致。這可能是由于有機肥配施化肥提高土壤結構穩定性、土壤養分含量以及生物活性，整體形成有利于細菌生長繁殖的良好環境[35]。本研究中，土壤pH、全磷和速效磷是影響土壤細菌多樣性的重要土壤因子，這與已有的研究結果基本一致[26-28]。RDA 分析結果也表明，全磷、速效磷和pH對土壤中的細菌群落結構有顯著影響，這說明不同的施肥措施會通過改變土壤養分和pH來影響茶園土壤細菌群落結構。有研究表明[36]，土壤pH已經被認為是影響全球土壤細菌群落變化的關鍵因子。本研究中，與CF處理相比，OF和OFM處理土壤pH分別顯著提高了0.85個和0.32個單位，因而部分與pH呈顯著正相關的放線菌門、厚壁菌門、黏球菌門和芽單胞菌門的相對豐度明顯增加（圖8），從而導致了土壤細菌群落結構的變化。Wu等[37]的研究認為，隨著全球氮輸入的增加，磷對土壤微生物生長過程的限制可能更大，適宜的土壤有效磷含量對土壤微生物在全球尺度具有積極影響，而土壤中大量的有效磷可能導致植物有益微生物的消耗，同時增加致病微生物豐度并影響植物健康[38-39]。本課題組前期研究結果顯示速效磷含量過高的茶園土壤致病菌含量顯著增加，而土壤有益菌含量顯著降低[40]。本試驗地茶園土壤有效磷含量較低（7.57 mg·kg^-1），施肥后土壤有效磷含量明顯增加，其中OF處理有效磷含量達到了優質高產茶園標準（gt;25 mg·kg^-1），適宜的土壤有效磷含量會改變生物群落結構和組成并會促進某些特定微生物的生長[41]。

不同施肥處理所引起的土壤環境變化會顯著影響微生物群落的組成[42]。本研究結果表明，不同施肥處理中細菌優勢菌群相似，但不同處理門和屬水平上的優勢類群的相對豐度差異顯著（圖3）。與CK處理相比，OF處理中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著增加了65.55% 和176.12%（Plt;0.05）；與CF 和CFC處理相比，OF處理黏球菌門的相對豐度顯著增加86.60% 和72.60%（Plt;0.05），但浮霉菌門的相對豐度也顯著降低了73.59%和63.58%（Plt;0.05）。盡管不同施肥處理土壤細菌優勢菌群基本相似，但是各施肥處理中土壤細菌群落結構的整體組成存在顯著差異（R²=0.442 1，P=0.001）。NMDS分析表明（圖4），CK 和CFC處理樣品存在明顯重疊區域，而OF和OFM處理土壤細菌群落結構與CF和CFC處理均有明顯差異，這表明連續6a 施肥已顯著改變茶園土壤細菌群落組成，其中OF處理影響更為顯著。OF處理土壤富集了更多的細菌分類群（33個進化枝，2個門，8個綱，8個目，8個科和7個屬），而這類菌群能夠起到溶解病原菌、防治植物土傳病害和分泌抗菌抑制劑等多種作用[43-45]。另外，變形菌門中的生絲微菌科（Hyphomi?crobiaceae）同樣在OF 處理中廣泛富集，這類富營養型細菌均具有較強的固氮功能，OF處理中黏球菌門中的多囊菌綱和多囊菌目相對豐度顯著增加，這說明有機肥配施化肥可能有利于驅動土壤中作物有益微生物群落結構穩定，從而降低土傳病害發生，緩解長期植茶帶來的連作障礙。

3.2 不同施肥措施對茶園土壤細菌功能類群和共現性網絡的影響

茶園土壤細菌生態功能類群以化能異養、有氧化能異養、固氮作用、纖維素分解和硝酸鹽還原作用功能類群為主（圖5），比例為65.63%～76.28%。與CF處理相比，OF處理中纖維素分解和錳氧化作用功能種群的相對豐度顯著降低（Plt;0.05），而捕食性或外寄生作用、光異養作用、光養作用、光合自養硫氧化和光能自養功能種群的相對豐度顯著增加（Plt;0.05），表明OF處理中有更高比例的細菌參與土壤碳氮循環，這與Gu等[26]的研究結果一致。同時OF處理中參與氮循環功能細菌種群豐度的提高，意味著降低氮肥施入量有利于土壤有機氮被微生物礦化[46]，從而釋放出更多無機氮供作物吸收利用，這可能也是適宜有機肥替代比例條件下茶葉提質增產的原因之一。

土壤微生物網絡分析為探索土壤微生物群落之間復雜的相互關系提供了新的途徑，可以識別影響土壤微生物群落結構和潛在功能最大的關鍵物種[47]，網絡節點數和邊數可以表示分子生態網絡的規模和復雜性[48]。本研究中，施肥后茶園土壤細菌分子網絡的拓撲學特征如連接數、平均連通度、度中心性及緊密中心性明顯提高，表明施肥增強了對環境擾動的抵抗性[49]，且中短期內（6a）茶園細菌網絡規模的擴大更加依賴于單施化肥。CF處理顯著增加了土壤堿解氮和全磷含量，有機肥配施化肥處理則通過增加土壤有機質、全氮和速效養分的含量顯著改善土壤肥力水平，土壤養分的提升能夠為細菌群落提供更多的資源生態位，從而能夠塑造和形成更加復雜的互作關系和共存網絡。由微生物菌群之間正負相關比例可見（表3），茶園土壤細菌菌群之間以正相關為主（正相關比例為58.03%～77.78%），表明在本研究的茶園土壤中細菌群落之間有更為緊密的協作關系；CK處理的細菌菌群正相關比例最高，有機肥配施化肥處理的正相關比例較低，表明施肥（尤其是有機肥配施化肥）加劇了茶園土壤細菌間競爭程度，這可能與有機肥中富含更易被細菌群落分解利用的半纖維素和蛋白質等簡單有機物有關[50]。此外，有機肥配施化肥處理的共現細菌類群多于CK和單施化肥處理（圖6），新增關鍵類群藍藻門和芽單胞菌門則與土壤養分循環和病原菌防控有關[51]，這在一定程度上說明有機肥配施化肥處理有利于促進土壤細菌群落生態位競爭。另外，微生物網絡平均路徑長度代表物種間傳遞物質、能量及信息的效率[52]，平均聚類系數表明微生物對外界環境因子擾動的敏感程度。相比于CK處理，各施肥處理的土壤微生物網絡平均路徑距離增加，平均聚類系數均有所下降，且有機肥配施化肥的變化程度要高于單施化肥，這意味有機肥配施化肥后土壤細菌響應速度變慢，外界環境變化不會在較短時間內影響整個細菌生態網絡，有利于提高細菌群落結構穩定性[53]。

4 結論

（1）6a田間試驗結果表明，施肥明顯提高了茶園土壤速效養分含量，與單施化肥相比，有機肥配施化肥顯著增加了土壤全磷、速效磷和速效鉀含量，提高土壤pH有效緩解了土壤酸化。

（2）施肥改變茶園土壤細菌多樣性，與不施肥處理相比，單施化肥降低了土壤細菌群落的Alpha多樣性，有機肥配施化肥則提高了土壤細菌的Alpha多樣性，而這主要與施肥后速效磷和pH的變化有關。

（3）茶園土壤細菌生態功能類群以化能異養、有氧化能異養、固氮作用、纖維素分解和硝酸鹽還原作用功能類群為主，有機肥配施化肥處理提高了細菌參與碳氮循環功能種群的相對豐度。

（4）施肥有助于茶園土壤細菌群落形成復雜的共生網絡，有機肥配施化肥可改變茶園土壤細菌群落結構，促進土壤細菌碳氮循環功能，提高細菌網絡規模和群落互作。