土霉素降解菌的篩選及降解特性

關鍵詞：土霉素；降解菌；DNA測序鑒定；降解特性；降解途徑

中圖分類號：X172 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2991-13 doi：10.11654/jaes.2023-1085

土霉素（Oxytetracycline，OTC）是由鏈霉菌產生的一類含有4個芳香環的并四苯為結構基礎的廣譜抗生素，是四環素類抗生素（Tetracycline antibiotics，TCs）之一，能阻止細菌核糖體酰氨-tRNA同核蛋白結合，抑制蛋白肽鏈的延長[1-2]，以及抑制革蘭氏陽性和陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體及濾過性病毒等微生物的生長繁殖[3]。土霉素具有廣譜抗菌性以及價格低廉的特點，被廣泛應用于臨床醫療和養殖業等眾多領域[4-6]。土霉素不僅能夠保障人類的生命健康，用于動植物疾病的治療和預防，還可以亞治療劑量添加于動物飼料，起到刺激動物生長和促進增產的作用[7]，使其逐漸成為生產生活不可或缺的組成部分。然而，隨之而來的是抗生素的過量使用與違規濫用。據統計我國每年有超過8 000 t抗生素被用作飼料添加劑[8]。

抗生素經過人和動物腸道時并不能被完全吸收，有60%～90%會以原形或代謝產物的形式由糞便和尿液排出體外[9]，導致有相當數量的活性成分進入自然環境中[10-11]并發生降解反應，但其很難完全降解生成二氧化碳和水，而是產生一系列毒性更大的代謝及降解中間產物[12]。這些產物能夠顯著抑制和影響植物的生長和發育[13]，抑制光合作用[14]；抑制水生動物體內多種酶的活性，造成魚類DNA損傷從而產生基因和免疫毒性[3]；殺死有益的微生物，誘導微生物逐漸對其產生抵抗性，影響微生物正常生長或繁殖，造成抗藥性菌群的富集及抗性基因（Antibiotic resistancegenes，ARGs）的產生[15-17]。其進入食物鏈后對人類健康也會形成潛在威脅。

環境中抗生素的殘留已經嚴重危害到動植物和人類的正常生活和發展，目前對環境抗生素處理的方法大致分為物理化學法和生物降解法，其中生物降解法投資費用低、綠色環保、無二次污染，可以用于大面積治理，是治理環境污染的有效手段[18-19]。目前已從環境中篩選出的能夠降解環境中抗生素的細菌包括產堿桿菌屬、氨氧化細菌、蒼白桿菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬等眾多菌屬[20-21]。Shao等[22]的研究表明，菌株KSS10在120h時對土霉素的降解率為78.78%，平均去除率為0.145 mg·L^?1·h^?1。Migliore等[23]的研究結果顯示，真菌Pleurotus ostreatus SMR684能夠在14d內完全降解100μg·mL^?1 的土霉素。然而，目前利用具有強耐藥性的菌株降解抗生素的研究實例不多，且大多是單菌降解抗生素。高效降解菌的篩選和多菌聯合降解對于進一步處理環境中抗生素殘留問題具有重大意義。因此，本研究選取獸藥中常用的土霉素為代表，篩選出兩株土霉素高效降解菌株，對其進行形態觀察、生理生化分析及基因測序分析，考察其最佳降解環境條件及聯合降解效果，為降解畜禽糞便和有機肥殘留抗生素提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用菌株的來源為本實驗室4 ℃冷藏保存的從蘇州某廢棄農藥廠土壤和地下水樣品中純化分離的菌株制成的試管斜面。土霉素標準品（C₂₂H₂₄N₂O₉，純度99.0%）購自南京草本源生物科技有限公司。色譜級甲醇、乙腈、甲酸均購自南京晚晴化玻儀器有限公司。試驗用水均由艾肯水精靈公司制造的RO超純水機制備。

1.2 培養基的配制

無機鹽液體培養基（MSM）：0.01 g 無水氯化鈣，1.5 g 三水合磷酸氫二鉀，3g磷酸二氫鉀，0.1 g 硫酸鎂，0.01 g亞乙基二氮基四乙酸，2 g 硝酸鉀，1000 mL超純水，根據其酸堿性用0.1 mol·L^-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節pH至7.0。

LB培養基：10 g胰化蛋白胨，5 g酵母提取物，10g 氯化鈉，1000 mL超純水，根據其酸堿性用0.1 mol·L^-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節pH至7.0。

高氏合成一號培養基：20 g可溶性淀粉，1 g硝酸鉀，0.5 g三水合磷酸氫二鉀，0.05 g氯化鈉，0.5 g七水合硫酸鎂，0.01 g七水合硫酸亞鐵，1 000 mL超純水，根據其酸堿性用0.1 mol·L^-1的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節pH為7.2～7.4。

固體培養基按1.5%～2.0%（V/m）的比例添加瓊脂。

1.3 試驗方法

1.3.1菌株的活化培養

將實驗室保存的菌株試管斜面根據菌株種類不同，分別選取不同的固體培養基，用平板劃線法在無菌條件下劃線活化，然后置于恒溫培養箱中30 ℃倒置培養48 h，觀察平板上菌落形態和鏡檢菌體形態是否一致，如不一致則重新劃線分離純化。最后將得到的菌株斜面保存備用。

1.3.2 菌株的篩選及鑒定

挑取純化的菌種接種到加入50 mg·L^-1 土霉素的固體平板培養基上，30 ℃培養48 h后挑選能夠長出菌落的菌株，按照3% 的接種量接種于含有50mg·L^-1土霉素且以其為唯一碳源的無機鹽液體搖瓶中進行復篩，72 h后取出5 mL 發酵液，9 500 r·min-1離心15 min，取上清液進行真空冷凍干燥。干燥結束后，用5 mL 甲醇-乙腈（1∶1，V/V）溶解干燥樣品，然后取1 mL經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后裝入棕色色譜瓶待測。

將篩選出的降解能力強的菌株，送測序公司（安徽通用生物技術有限公司）進行DNA提取和測序，根據16S rDNA測序結果，在NCBI網站Gen Bank數據庫在線進行98%同源性比對，確定菌種名稱，用MEGA8構建系統發育樹。同時進行菌落形態和細菌形態的觀察，以及菌株的生理生化試驗。

1.3.3生長曲線

將降解菌按3% 接種量接種在含有50 mg·L^-1土霉素的無機鹽液體培養基中，30 ℃、130 r·min^-1的條件下搖床培養，每個處理3次重復，分別在第0、2、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 小時采樣，用紫外分光光度計在600 nm的波長下測定菌液的OD值，由此確定菌株的生長曲線。

1.3.4 制備菌懸液

在LB液體培養基中培養純化后的單菌落，于30 ℃、130 r·min^?1恒溫振蕩條件下培養至渾濁，隨后在室溫條件下于4000 r·min^?1離心10 min，保留濕菌體。用無菌生理鹽水（0.9%的NaCl溶液）對菌體進行重懸，最后用生理鹽水配制成OD600=1.0的菌懸液。

1.3.5 環境條件對菌株降解土霉素的影響

將篩選出的降解能力強的兩株菌株按照體積比1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1混合，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，土霉素濃度為35、50、65、80、95 mg·L-1，溫度設置為25、30、35、40 ℃，pH 為5、6、7、8、9，碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉、乙酸鈉、麥芽糖，氮源為明膠、尿素、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉，調節搖床轉速為130 r·min^-1，用高效液相色譜儀測定3d后的OD600和土霉素的濃度，計算降解率，比較環境因子對降解菌降解土霉素的影響。對照處理條件為：兩菌株體積比1∶1，接種量3%，土霉素濃度50 mg·L^-1，溫度30 ℃，pH 7，不添加碳、氮源。每個處理均設置3個重復。

1.3.6 測定條件

使用高效液相色譜儀（型號1260，美國安捷倫公司）測定土霉素濃度。色譜條件：色譜柱為ZORBAXSB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）不銹鋼柱；流動相A組分是0.1%甲酸水溶液，B組分是乙腈；柱溫30 ℃；流速0.8 mL·min^-1；進樣量20 μL；檢測器為紫外吸收檢測器，檢測波長為278 nm；梯度洗脫程序見表1。

降解率=（對照樣品的殘余濃度-試驗樣品的殘余濃度）/對照樣品的殘余濃度×100%。

利用液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS，色譜柱為XBridge C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）分析土霉素降解的中間產物。質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監測（MRM），離子源溫度為150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，掃描范圍為50～600 m/z。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、篩選及生理生化鑒定

經過活化、初篩、復篩，得到兩株土霉素降解能力較好的菌株W和P2，平板上的P2菌落表面粗糙不透明、微黃色、易挑起，W菌落為圓形、表面光滑、邊緣整齊的乳白色不透明小凸起（圖1），P2為革蘭氏染色陽性菌，W 為革蘭氏染色陰性菌（圖2），兩株降解菌的生理生化特征見表2。

將兩株降解菌的16S rDNA測序結果上傳至NCBI網站并進行同源性比對分析，結果表明：P2菌株的特征基因序列與多種芽孢桿菌屬菌株具有98%以上的同源性，將P2所測序列結果提交到Gen Bank數據庫，獲得序列登錄號為PP178578；而W菌株的特征基因序列與多種埃希菌屬菌株具有98%以上的同源性，將W所測序列結果提交到Gen Bank數據庫，獲得序列登錄號為PP178579。兩菌株的系統發育進化樹如圖3所示。

2.2 菌株P2和W的生長曲線

圖4顯示，接入菌株W、P2后，其OD₆₀₀值迅速降低，這是菌株剛接種到以土霉素為唯一碳源的無機鹽培養基中，對新環境的一個適應期，菌株生長繁殖緩慢。8 h 后OD₆₀₀值有所上升，并且P2菌株在16 h達到最大生長值0.025，W菌株在40 h達到最大生長值0.055，說明菌株在經過生長遲緩期后，迅速進入對數生長期，且W菌株比P2菌株適應性更好。W菌株在48 h后，P2菌株在16 h后的OD₆₀₀值均呈現一定的下降趨勢而后趨于穩定，這可能與土霉素為唯一碳源，且降解產物對這兩株菌株生長具有一定抑制作用有關。

2.3 菌株P2和W對土霉素的降解率

圖5顯示了菌株W、P2對土霉素的降解率隨著降解時間持續的變化過程。由圖5可知，隨著降解時間的延長，W菌株對土霉素的降解率逐漸升高，這說明W菌株在適應了土霉素為唯一碳源的環境后，進入生長對數期并且開始大量降解土霉素，且隨著時間的延長，降解率提高。但是P2菌株隨著降解時間的延長，對土霉素的降解率呈現先升高后降低的趨勢，并在第3天時達到最高，這一結果符合菌株自身對抗生素降解效果的動態平衡，這是因為菌株在生長階段和衰退階段，隨著菌株總量的積累，對抗生素的降解率逐漸升高，之后由于菌量低于某一閾值以及土霉素降解產物對菌株進行抑制，降解率開始降低，直至趨于土霉素自然降解率。

2.4環境條件對菌株P2和W降解土霉素的影響

2.4.1混合比例

接種總量為3%體積分數，兩株菌株的體積混合比例分別為W∶P2=1∶0、0∶1、1∶1、2∶1、1∶2，將菌液接種于含有50 mg·L^-1土霉素的中性無機鹽培養基中，在溫度為30 ℃，轉速為130 r·min-1的條件下培養3 d，結果見圖6?；旌媳壤秊?∶1時，菌株對土霉素的降解率最高，達到了13.85%，且菌株的OD₆₀₀值也最大，說明在這個混合比例下，兩菌株的生長最為旺盛，對土霉素的降解能力也最強，因此，選取兩株降解菌的接種比例為1∶1，接種總量為3% 體積分數作為進一步研究的條件。

2.4.2 初始濃度

將體積分數為3%，兩株菌株混合比例為1∶1的菌液分別接種到土霉素濃度為35、50、65、80、95 mg·L^-1的無機鹽培養基中。在溫度為30 ℃，pH為7，轉速為130 r·min^-1的條件下培養3 d，結果見圖7。降解率隨著土霉素初始濃度的升高呈現先升高后降低的趨勢，在65 mg·L^-1時降解率達到最高，為19.33%，而此時菌株的OD₆₀₀值也達到最高，這是由于低濃度時，土霉素作為唯一碳源不能滿足菌株生長繁殖的需求，而高濃度時，土霉素又作為藥物抑制了菌株的生長繁殖。

2.4.3 初始pH

在50 mg·L^-1土霉素，pH依次為5、6、7、8、9的無機鹽培養基中，接種體積分數為3%，兩株菌混合比例為1∶1的菌液，在溫度為30 ℃，轉速為130 r·min^-1的條件下培養3d，結果見圖8。降解率隨著pH的升高而降低，pH為5時降解率最高，為24.29%，pH為9時降解率最低，為4.27%。菌液OD₆₀₀值的變化趨勢與降解率變化趨勢一致，說明在酸性條件下菌株的生長狀況更好，對土霉素的降解率也更高，堿性條件抑制兩株菌對土霉素的降解。

2.4.4 接種量

將兩株菌混合比例為1∶1，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5% 的菌液接種于含有50 mg·L^-1 土霉素的無機鹽培養基中，調節pH 為7，在溫度為30 ℃，轉速為130 r·min^-1 的條件下培養3d，結果見圖9。隨著接種量的增加，菌液的OD₆₀₀ 值也在逐漸增加，在接種量為5% 時達到最大值0.079，而降解率先升高后降低，在接種量為3% 時達到最大值20.66%，這可能是因為培養液中的菌體之間會因為爭奪營養物質而產生競爭關系，從而影響其對土霉素的降解。

2.4.5 溫度

大部分的文獻資料顯示，菌種的最佳生長溫度在30～35 ℃之間，因此本試驗在最適溫度界限上下設置溫度梯度，分別為25、30、35、40 ℃，接種體積為3%，混合比例為1∶1的菌液于含有50 mg·L^-1土霉素的無機鹽培養基中，在pH為7，轉速為130 r·min^-1的條件下培養3 d，結果見圖10。隨著溫度升高，降解率和OD₆₀₀值均呈現先升高后降低的趨勢，并且在35 ℃時分別達到最大值10.65%和0.054，造成這種現象的原因可能是菌株分泌的土霉素降解酶的最適溫度為35 ℃，溫度過高或過低對降解效果均有一定的影響，同時，由于降解效率的降低，菌株在該環境中生存受限，最終反映在菌株OD600值的降低。

2.4.6 外加碳源

在分別含有2g乙酸鈉、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖的50 mg·L^-1土霉素無機鹽培養基中接種體積分數為3%，兩株菌混合比例為1∶1 的菌液，在溫度為30 ℃，pH為7，轉速為130 r·min^-1的條件下培養3 d，結果如圖11所示。CK處理下，聯合菌株對土霉素的降解率僅為12.02%，外加碳源后，降解率大幅度增加，說明外加碳源對降解率的影響較大。降解菌不僅可以利用土霉素作為唯一碳源進行分解代謝，外加麥芽糖作為共代謝碳源時，菌株營養物質更充足，生長更快，土霉素的降解率也提高到86.66%，所以麥芽糖是最優外源碳源。

2.4.7外加氮源

在分別含有2 g明膠、尿素、胰蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉的50 mg·L^-1土霉素無機鹽培養基中接種體積分數為3%，兩株菌混合比例為1∶1 的菌液，在溫度為30 ℃，pH為7，轉速為130 r·min^-1的條件下培養3 d，結果如圖12所示。與CK相比，外加氮源后降解率均有一定程度的增加，說明外加氮源對降解率的影響較大，其中外加硝酸鈉時，降解率最高，達到85.15%，為最優氮源，而外加尿素時，降解率僅為25.73%，可能是降解菌對尿素的利用程度不高，不能大幅提升降解效果。

2.5 土霉素降解產物及潛在的降解途徑

為了更好地了解菌株W和P2對土霉素降解的中間產物和潛在的降解途徑，使用液相色譜-質譜聯用法分別檢測土霉素標準物質、空白樣品和單加P2、單加W、W 與P2 聯合降解樣品，得到質譜結果如圖13至圖17所示。

首先根據標準品和空白樣品排除色譜柱內殘留的雜質峰和確定土霉素的物質峰，然后根據單加P2、單加W推測單株菌降解土霉素的途徑，與W和P2聯合降解樣品進行對比，推測聯合降解潛在的共同降解途徑。可能的降解產物的推測依據質譜圖中豐度較高的質荷比、物質庫對照以及已發表文獻，根據已有研究中土霉素主要的降解路徑以及合理的質量丟失，提出4種潛在的土霉素降解途徑，結果如圖18所示。

途徑Ⅰ：在W菌株作用下，母體化合物土霉素先經過C5位置的氧化脫氫和C4位置的二甲氨基脫甲基，形成化合物m/z=432，再在C2 位置脫酰胺基，C6位置脫水、脫甲基，C12a位置脫羥基后轉化為化合物m/z=340，然后在C5位置脫羰基，在C4a和C12a位置的苯環裂解，形成化合物m/z=211，最后在C1位置脫羥基，生成產物4-氫-蒽-9-酮（m/z=194）。

途徑Ⅱ：在W菌株作用下，土霉素先在C2位置脫酰胺基，C4位置的二甲氨基脫甲基形成化合物m/z=397，再經過C6位置脫水、C5和C12位置的苯環裂解，形成化合物m/z=218，C2位置再脫羧基，C4位置脫甲基，C8位置脫羥基形成產物4-氫-萘-1-酮（m/z=141）。

途徑Ⅲ：在P2菌株作用下，土霉素先經過C5位置的氧化脫氫轉化為化合物m/z=459，再經過C4位置二甲氨基的脫甲基化，C5a和C11a位置的苯環裂解，分解形成化合物m/z=191和m/z=291，化合物m/z=191再經過C5位置脫甲基、脫羥基形成1-羥基-5H-萘-8-酮（m/z=167），m/z=291 再進行C4 位置的脫胺基、C3、C8a位置脫羥基和C2位置脫酰胺基形成化合物m/z=141，進一步分解為小分子1，3-環己二酮（m/z=123）。

途徑Ⅳ：在W和P2菌株共同作用下，土霉素先經過C1位置的脫羰基，C2位置的脫酰胺基，C3、C12a位置的脫羥基轉化為化合物m /z=377，再經過C2 和C12a位置苯環的裂解，C4位置二甲氨基的脫甲基形成化合物m/z=321，然后C1位置脫羥基，C3位置脫氨基，C10 位置脫水形成化合物m/z=262，最后經過C4和C9a位置苯環的斷裂，生成產物1-羥基-5-甲基-7-氫-萘-8-酮（m/z=175）。

3 討論

環境中抗生素的殘留對人類健康和生態系統具有極大的威脅，因此研究抗生素降解技術備受社會關注。而微生物可以以抗生素為唯一碳源和能源，通過微生物分泌胞外酶進行氧化、還原、基團轉運、水解等，參與細胞代謝，最終生成CO₂和H₂O等[24-25]，具有投資少、沒有二次污染物、環境擾動小等優點，因而成為國內外研究熱點。

從環境中篩選出可以降解四環素類抗生素菌株的報道不斷出現，如光合菌、乳酸菌、放線菌、酵母菌、發酵絲狀菌、芽孢桿菌、枯草桿菌、硝化細菌、酵母等都具有降解抗生素的功能[9]。張小紅等[26]發現一株可同時降解土霉素、四環素、金霉素及強力霉素的降解菌TCs-2，初步鑒定其為潘多拉菌屬（Pandoraea sp.）。成潔等[27]發現木糖氧化無色桿菌（Achromobacter sp.）TJ-2#、枯草芽孢桿菌（Bacillus sp.）TJ-6#對土霉素的降解率分別為58.3%、49.6%。張長青[28]發現蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在第8 天時對50 mg·L^-1 土霉素的降解率達到82.38%。也有研究表明，由于環境中污染物組成成分復雜，依靠單一降解菌很難達到理想效果，而由不同降解菌組合成的降解菌群相對于單菌而言，其降解性能更加優異[29]。研究表明，有效微生物生物量與污染物降解率呈正相關關系，投加的降解菌生物量越多降解率越高[30]。本研究篩選出兩株有降解土霉素能力的降解菌W和P2，其分別屬于埃希菌屬和芽孢桿菌屬，對其進行最佳配比，使兩株菌對土霉素進行1∶1聯合降解，以提高土霉素的降解效果。曾洪等[31]發現當土霉素降解菌OTC-1培養時間超過6 d時，菌株的生長量開始下降，這可能是因為土霉素被菌利用后產生具有抑菌性的中間代謝產物，從而降低了微生物活性，該結果與本研究結果相似。

邵思城[32] 發現蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）KSS10對土霉素的最優降解條件為：土霉素初始濃度56.31 mg·L^-1、溫度32.48 ℃、溶液初始pH 5.45和接種量16.07%（V/V）。這與本試驗篩選出的最佳降解條件為土霉素初始濃度65 mg·L^-1、接種量3%、pH 5、溫度35 ℃基本一致。于浩等[33]發現了土霉素優勢降解菌株短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）YH1，添加不同的碳源、氮源均有利于該菌株對土霉素的降解，其中加入蔗糖和麥芽糖可以明顯提高降解率，添加麥芽糖后降解率提高至71.89%，添加酵母浸液后降解率提高至64.91%。本試驗中，最優碳源為麥芽糖，土霉素降解率提高到86.66%，最優氮源為硝酸鈉，土霉素降解率提高至85.15%。

土霉素的降解路徑主要為母體結構中苯環的裂解、取代基的降解以及OH、NH₂、CH₃、CONH₂等基團的去除[34-37]。本研究發現4 種潛在的土霉素降解途徑，降解過程主要包括羥基化、苯環裂解、脫氫、脫水、脫甲基、脫羥基、脫胺基和脫酰胺基反應。石建惠等[38]發現光芬頓體系降解土霉素的中間產物，其中OTC10 與本研究獲得的降解產物之一m/z=175 較為一致。周婷[39]發現光催化氧化土霉素的產物m/z=432、m/z=191 的結構均與本研究獲得的降解產物m/z=432、m/z=191 較為一致。陳棟[40]發現電化學氧化土霉素的降解產物之一m/z=432致突變性高于土霉素本身，與本研究推測產物m/z=432的結構不相似。

抗生素的微生物降解研究目前仍處于起步階段，微生物技術固有的限制特點使得該項技術現在仍普遍處于實驗室研究階段，且多數研究僅考慮單一微生物和抗生素的降解，代謝機制的研究以及實際應用的開展等還需要大量的工作。要將微生物修復技術進行大規模工程應用，還需要加快尋找廉價、有效的促進降解菌生長的營養鹽和微生物載體，加強對微生物作用過程中間代謝產物及酶的研究，運用現代生物工程技術構建高效基因工程菌，以及針對性地采用多種修復技術相結合的聯合修復方案。本研究篩選得到的P2和W 菌株對土霉素有較好的降解作用，具有潛在的實際使用價值，為雙菌共同降解土霉素提供了參考。

4 結論

（1）從實驗室保存的蘇州某廢棄農藥廠土壤和地下水樣品中純化分離的菌株中，篩選分離出兩株土霉素降解菌株W和P2，根據兩菌株的形態、生理生化特征及16S rDNA鑒定，P2屬于芽孢桿菌屬，W屬于埃希菌屬。

（2）不同環境條件下，兩菌株對土霉素的降解效果不同。在土霉素初始濃度為65 mg·L^-1，混合比例為1∶1，接種量為3%，pH為5，溫度為35 ℃，外加碳源為麥芽糖，外加氮源為硝酸鈉時，W和P2對土霉素的降解效果最佳。其中外加碳、氮源對降解菌降解土霉素的影響最大。

（3）發現4種潛在的土霉素降解途徑，降解過程主要有苯環裂解、脫氫、脫水、脫羰基、脫甲基、脫羥基、脫胺基和脫酰胺基反應，中間降解產物分別為4-氫-蒽-9-酮（m/z=194）、4-氫-萘-1-酮（m/z=141）、1-羥基-5H-萘-8-酮（m/z=167）、1，3-環己二酮（m/z=123）、1-羥基-5-甲基-7-氫-萘-8-酮（m/z=175）。