食品中γ-谷氨酰肽的研究進展

◎ 林 順，劉 希，王琦文，童 星

（1.佛山市海天（高明）調味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.廣東海天創新技術有限公司，廣東 佛山 528000）

γ-谷氨酰肽是由谷氨酰胺或谷氨酸的γ-羧基和氨基酸或肽分子的α-氨基發生脫水縮合反應所得的一類小分子肽，廣泛存在于自然界中[1]。研究者在不同食物中也發現了新的γ-谷氨酰肽，如醬油、大豆、奶酪、大蒜、洋蔥、魚制品和酵母抽提物[2]。在19 世紀90 年代，人們發現γ-谷氨酰肽是賦予這些食物濃厚風味（口感飽滿、連續性和持續性）的主要貢獻成分[3]，這也引發了學術界對γ-谷氨酰肽感官特性的各種研究。2010 年，OHSU 等[4]報道了γ-谷氨酰肽是細胞外鈣敏感受體（Calcium-Sensing Receptor，CaSR）激動劑，可以間接增強kokumi 味覺感受。除了味覺作用之外，人們還研究了γ-谷氨酰肽參與人體生理活性的多種機制，發現其具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血壓、調節心血管系統以及金屬離子螯合[8]作用等，使人們進一步認識到了γ-谷氨酰肽的功能與價值[9]。

1 γ-谷氨酰肽的生理活性

1.1 激活kokumi 風味感知

CaSR 激活劑包括肽、氨基酸、多胺、陽離子和氨基糖苷類抗生素[8]。BROADHEAD 等[9]提出CaSR的細胞外捕蠅草結構域是γ-谷氨酰肽的結合位點，這種結合導致細胞內Ca2+水平升高，產生kokumi 味覺的神經信號。很多研究表明CaSR 的活性與γ-谷氨酰肽的kokumi 強度呈正相關[10]。有研究者使用非洲爪蛙卵母細胞和人胚胎腎（HEK）-293 細胞測試了近百種γ-谷氨酰肽的CaSR 活性及其kokumi 味覺強度，進一步證實了γ-谷氨酰肽的結構特征能夠激活CaSR，并引發kokumi 感覺[11]。引起高CaSR 活性和醇厚味的肽通常在N 端具有γ-谷氨?；?，在第二個殘基處具有脂肪族、中性、中等大小的取代基，并且優選在C 端為甘氨酸的羧基[12]。

1.2 抗炎活性

γ-谷氨酰肽在人體中表現出各種類型的抗炎作用。例如，有研究者將膳食二肽γ-谷氨酰纈氨酸（γ-EV）和γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-EC）鑒定為具有健康促進因子的抗炎肽。其中γ-EV 和γ-EC可 改善葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎癥、結腸縮短、體重減輕和組織學損傷引起的臨床癥狀[13]。γ-EC 能夠保護Wistar 大鼠的肝組織免受鎘和鐵誘導的肝細胞損傷，增加肝組織中的抗氧化能力，減少促炎細胞因子，增加抗炎細胞因子，進而可以調節人體代謝疾病的發生[5-6]。

1.3 改善血糖

二肽基肽酶（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP-4）廣泛存在于人和動物體內，是一種絲氨酸水解酶，可水解各種肽，包括生長激素釋放激素、腸神經肽、胃泌素釋放肽和腸促胰島素[14]，其中腸促胰島素會導致血糖升高，因此被認為是針對2 型糖尿病的潛在治療靶點。目前，許多研究人員專注于尋找可以成為有效DPP-4 抑制劑的新型化合物，通過阻止DPP-4 分解胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1），進而提高GLP-1 的水平，發揮控制血糖作用，是目前治療糖尿病的主攻方向之一。例如，有研究篩選了21 種γ-谷氨酰二肽的DPP-4 抑制活性，其中γ-Glu-Met、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Leu和γ-Glu-Tyr 被發現對DPP-4 表現出競爭性抑制作用[15]，γ-谷氨酰肽也被證明可以以CaSR 依賴的方式改善餐后血糖[16]。

1.4 調節膽囊收縮素和抑制食欲活動

膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）是一種腸腦肽激素，參與刺激蛋白質和脂肪的消化。它由胃腸道十二指腸細胞分泌，還參與胰腺生長、胃腸蠕動和抑制胃酸分泌，有助于抑制食欲，從而減少食物攝入。因此，CCK 是控制和預防肥胖的有效治療靶點。包括γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Cys 和γ-Glu-Ala 在內的γ-谷氨酰肽可通過變構調節CaSR，增加細胞內cAMP的濃度[9]。因此，γ-谷氨酰肽具有調節腸道激素的巨大潛力，能夠抑制食欲和控制食物攝入。

1.5 其他生物活動

SCV-07（γ-Glu-Trp）是一種新型免疫調節肽，具有抗結核病的廣譜免疫調節活性，能夠減輕口腔黏膜炎癥狀[17]。γ-谷氨酰肽也存在于人體中，它們在體內的積累增加可能與疾病的發作有關，因此可以作為診斷某些疾病的指標。據報道，神經組織中γ-Glu-Lys的積累增加是神經系統疾病的診斷指標[18]。

2 γ-谷氨酰肽的提取和分離

γ-谷氨酰肽在很多食物中都存在，并且對這些食物濃厚、持續、復雜的口感有重要貢獻，很多研究者對其進行了分離和鑒定。UEDA 等[19]使用Duolite C-25 離子交換樹脂和反滲透膜提取分離了大蒜中的kokumi 關鍵呈味物質，然后使用質譜和核磁共振對該物質進行了鑒定，結果為(+)-S-甲基-L-半胱氨酸亞砜和γ-L-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸。該研究團隊還采用水提和乙醇提取方法分析發現了PeCSO和γ-Glu-PeCSO，并證實其為洋蔥特有醇厚風味的重要組成[3]。ROUDOT-ALGARON 等[20]采用液體CO2沉淀及檸檬酸鹽緩沖液分離，然后使用凝膠滲透色譜法和反相高效液相色譜純化，并通過質譜法進行分析，確定kokumi 風味的主要貢獻物為γ-Glu-Leu、γ-Glu-Tyr 和γ-Glu-Phe。另外一些研究應用超濾、凝膠過濾色譜和高效液相色譜的組合從干鯡魚片、大豆種子和牛骨髓的水提取物中純化γ-谷氨酰肽[21-23]。

3 γ-谷氨酰肽合成

雖然γ-谷氨酰肽存在于多種食物中，但是含量太低，且提取分離的成本很高，因此采用生物合成法是獲取大量γ-谷氨酰肽最經濟、有利的途徑。γ-谷氨酰肽的生物合成主要利用酶的催化作用和微生物發酵實現，目前文獻報道的可以催化合成γ-谷氨酰肽的酶主要包括谷氨酰轉肽酶（EC 2.3.2.2）、谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（EC 6.3.2.2）[8]。

3.1 γ-谷氨酰肽生物合成

3.1.1 γ-谷氨酰轉肽酶

γ-谷氨酰轉肽酶（Gamma-Glutamyltransferase，GGT）是一個異二聚體，具有分子量大小不同的兩個亞基，屬于N-末端親核氨基水解酶類，可催化γ-谷氨?；霓D移反應和谷氨酰胺的水解反應。發生反應時，γ-谷氨酰轉移酶小亞基N-末端蘇氨酸的活性氧原子攻擊γ-谷氨酰基供體形成γ-谷氨酰-酶復合體，當親核試劑為氨基酸或肽分子時發生轉肽反應，為水分子時發生水解反應，當供體肽的第二個底物充當受體，則被稱為自轉肽（圖1）[8]。由于這兩種反應的最佳pH 值不同，酶可以選擇性地催化其中一種反應。利用不同的氨基酸作為γ-谷氨酰受體，可以合成各種γ-谷氨酰肽。例如，SUZUKI 等[1]采用大腸桿菌生產的GGT 合成了γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-谷氨酰乙酰胺。該研究者還將GGT 用于Phe、Val、Leu 和His 的γ-谷氨酰基化以降低其苦味，并發現催化合成γ-Glu-Phe 的最佳反應條件為Gln 200 mmol·L-1、Phe 200 mmol·L-1、GGT 0.5 U·mL-1、pH 值為10.4、37 ℃孵育1.5 h，該條件下可得到140 mmol·L-1γ-Glu-Phe，產率為70%。對于大規模工業應用，通常會優選GGT，這是因為GGT 不需要使用ATP 進行轉移反應。此外，細菌GGT 已被證明比哺乳動物GGT 更有益，因為它們具有非糖基化蛋白質、更高的溶解度和更廣泛的底物選擇性，與哺乳動物GGT 相比，細菌GGT 能夠產生多種γ-谷氨?；衔?。此外，哺乳動物GGT 需要使用谷胱甘肽作為γ-谷氨酰供體，而細菌GGT 可以使用廉價的谷氨酰胺。細菌GGT 對生產藥學相關肽也很重要，如通過大腸桿菌GGT 合成的γ-L-谷氨酰-二羥基苯丙氨酸已被證明是一種有前途的帕金森病治療藥物，其能夠增加大腦中的多巴胺水平[24]。大腸桿菌GGT 也被用于以L-谷氨酰胺為供體合成γ-谷氨酰牛磺酸和γ-Glu-Trp，對鼠結核病具有免疫調節作用[25]。

圖1 不同酶合成γ-谷氨酰肽作用機制圖

3.1.2 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶是一種水解酶，廣泛存在于酵母、細菌和真菌等微生物中，主要催化谷氨酰胺水解成谷氨酸。然而，某些谷氨酰胺酶也可以催化γ-谷氨酰部分從谷氨酰胺轉移到各種肽或氨基酸以產生γ-谷氨酰肽（圖1）[26]。YANG 等[27]驗證了解淀粉芽孢桿菌（GBA）和米曲霉（GAO）谷氨酰胺酶產生γ-[Glu]n-Phe 肽的轉肽酶活性。在Gln 和Phe 的存在下，GAO 合成了γ-Glu-Phe 和γ-Glu-γ-Glu-Phe，GBA合成了γ-[Glu](1 ≤n＜5)-Phe，GBA 在轉肽反應中對Phe和γ-Glu-Phe的親和力大于GAO。合成γ-[Glu]n-Phe 的最佳條件是pH=10，合成溫度37 ℃，底物為300 mmol·L-1Gln、100 mmol·L-1Phe 和0.05 U·mL-1GBA，保溫時間3 h[28]。TACHIKI 等[29]采用硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）源的谷氨酰胺酶，可催化谷氨酰胺中的γ-谷氨酰部分轉移到甲基或者乙基上，進而合成了茶氨酸。然而，與GGT 相比，γ-谷氨酰轉移酶有限的活性和較窄的底物特異性，導致谷氨酰胺酶通常不是工業應用的首選酶。

3.1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glutamylcysteine Synthetase，γ-GCS）通過連接谷氨酸與半胱氨酸，在谷胱甘肽合成反應中催化γ-谷氨酰-半胱氨酸的合成。該酶還能催化其他氨基酸與谷氨酸反應，生成不同的γ-谷氨酰肽（圖1）[30]。KOBAYASHI 等[30]報道了在GCS 催化活性中，半胱氨酸的Km值最低，為0.06 mmol·L-1，而其他氨基酸的Km值則更高，為21～1 800 mmol·L-1。表明在產生γ-谷氨酰肽過程中，除半胱氨酸外，其他氨基酸不是GCS 受體的首選。NAKAYAMA 等[31]研究發現，從奇異變形桿菌中純化的GCS 能夠合成不同的γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Lys和γ-Glu-Ala 等，該酶的最佳催化條件為溫度30 ℃、pH=8.5 孵育24 h。然而，該酶的局限性在于需要ATP進行催化，并且在反應過程中產生的ADP 和最終反應產物可能通過反饋抑制機制導致產率降低[32]。

3.2 γ-谷氨酰肽微生物發酵

許多發酵食品都會積累γ-谷氨酰肽，這歸因于原料中微生物或酶的代謝活動。例如，谷物發酵中的谷胱甘肽是微生物內部谷胱甘肽還原酶的催化作用產生的[33]。有研究人員在酵母自溶物中發現了谷胱甘肽[34]。XIE 等[35]利用羅伊氏乳桿菌γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（Glutamate Cysteine Ligase，GCL）的活性，從以14 種氨基酸為底物的體系中合成了γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Ala、γ-Glu-Met、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Phe等。SOFYANOVICH 等[36]報道了在酵母提取物中發現的γ-EVG 是由釀酒酵母通過兩種途徑合成得到：以谷氨酸、纈氨酸和甘氨酸作為前體，由GCL 和GS 酶的催化作用產生；通過（Dug2p-Dug3p）2 復合物介導γ-谷氨酰部分從谷胱甘肽轉移到二肽Val-Gly 上產生γ-EVG。然而，由微生物發酵作用產生的γ-谷氨酰肽濃度較低，提取和純化的成本比較高。

4 結語

γ-谷氨酰肽廣泛存在于天然動植物及日常食物中，不僅可以改善食品的風味，提升濃厚感，還具有抗炎、抗氧化、降血壓以及心血管系統調節等多方面的生理作用，在食品風味提升及天然健康物質合成方面有著巨大的應用價值。但是，目前除了谷胱甘肽具備工業化基礎之外，其他結構及功能的γ-谷氨酰肽仍然缺少高效成熟的生產技術，其在合成過程中仍存在以下科學難題急需解決。①谷氨酰胺酶受體的轉移活性較低，谷氨酰轉肽酶催化效率仍處于實驗室水平，需要通過酶工程和細胞工程技術構建γ-谷氨酰肽催化酶劑的高效表達。②通過基因工程改造載體細胞，優化代謝通路，實現微生物發酵生產γ-谷氨酰肽的工業化可行路線。③γ-谷氨酰肽通過激活味覺中CaSR 達到增強濃厚感的效果，但其深層的分子作用機制尚不清楚，對于濃厚感風味具有協同作用的物質缺少相關研究。所以，加強γ-谷氨酰肽的深入研究對未來健康食品行業的發展具有重要意義。