高效液相色譜法測定豬肉中8 種磺胺類藥物的殘留

◎ 寧舵華，趙 妍

（漢臺區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心，陜西 漢中 723000）

磺胺類藥物屬于合成源的廣譜抗菌劑，它可以抑制微生物體內(nèi)的二氫葉酸合成酶，使微生物二氫葉酸合成受阻，進(jìn)而影響微生物核苷酸和核酸的合成，最終抑制微生物的生長和繁殖[1-2]。磺胺類藥物具有使用方便、藥物毒性低、抗菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定以及價格低廉的優(yōu)點，因此在動物養(yǎng)殖過程中被廣泛應(yīng)用，長期不合理使用磺胺類藥物，會使動物產(chǎn)生耐藥性，人們食用含磺胺類藥物殘留的動物性食品，會對身體產(chǎn)生危害。磺胺類藥物極易吸附在土壤中，且難以降解，會污染水資源，破壞生態(tài)環(huán)境[3-4]。因此，對動物性食品中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行準(zhǔn)確測定具有重要意義，通過對動物性食品中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行檢測可以確保動物性食品的安全性，減少環(huán)境污染[5]。

磺胺類藥物兼具酸堿兩性[6]，易溶于有機(jī)溶劑，根據(jù)其理化特性，當(dāng)前實驗室檢測磺胺類藥物主要采用高效液相色譜法-紫外檢測法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其中質(zhì)譜檢測法具有分離能力強、準(zhǔn)確性高等特點，但是質(zhì)譜法存在儀器成本高，操作復(fù)雜等問題，基層農(nóng)產(chǎn)品檢測實驗室通常難以普及，而基層農(nóng)產(chǎn)品檢測實驗室?guī)缀醵寂渲糜懈咝б合嗌V儀，結(jié)合本實驗室相關(guān)配置情況，采用高效液相色譜法-紫外檢測法來測定豬肉中磺胺類藥物殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：豬肉監(jiān)督抽檢樣，于-20 ℃保存；乙酸乙酯、甲醇、正己烷（色譜純，默克）；乙腈、甲酸（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；鹽酸、氨水（優(yōu)級純，滬試國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司）；固相萃取柱MCX 柱（沃特世）；0.2 μm 有機(jī)濾膜（天津市津騰實驗室設(shè)備有限公司）；純水（一級水）；磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺二甲氧噠嗪和磺胺吡唑共8 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 安捷倫液相色譜儀（VWD，美國安捷倫公司）；AUW220D 型電子分析天平（日本島津公司）；JY601 型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；Vm-01u（HYQ-3110）型旋渦振蕩器（寧波新芝科技有限公司）；H1850R 型高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

將濃度為100 μg·mL-1的8 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液分別轉(zhuǎn)移到10 mL 棕色容量瓶內(nèi)，隨后以乙腈為稀釋劑進(jìn)行定容操作，制得濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，并在-18 ℃下冷凍保存。分別吸取8 種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL，放入10 mL 的棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容，配制成濃度為1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合液，-18 ℃冷凍保存。用0.1%甲酸乙腈溶液將標(biāo)準(zhǔn)混合液分別稀釋成0.03 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.07 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

0.1% 甲酸溶液，吸取1 mL 甲酸溶液放置到1 000 mL 的容量瓶中，用純水溶解稀釋定容至1 000 mL；0.1%甲酸乙腈溶液，吸取配制好的0.1%甲酸溶液830 mL，放置到1 000 mL 容量瓶中，用乙腈溶解稀釋定容至1 000 mL；0.1 mol·L-1鹽酸溶液，吸取鹽酸溶液0.83 mL，用純水溶解稀釋定容至100 mL；50%甲醇乙腈溶液，量取50 mL 甲醇溶液放置到100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋溶解定容到100 mL；氨水洗脫液，吸取氨水5 mL 放置到100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀釋定容至100 mL。

1.3.2 色譜分析條件

色譜柱型號：C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；紫外檢測器波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相流速：1.0 mL·min-1，流動相組成見表1。

表1 流動相組成表

1.3.3 分析步驟

（1）提取。稱取（5±0.05）g 豬肉樣品，放置到100 mL 的離心管中，加入20 mL 乙酸乙酯，進(jìn)行漩渦振蕩，設(shè)置時長為2 min，振蕩結(jié)束后，在4 000 r·min-1下離心5 min，離心結(jié)束后，取上清液放置到100 mL梨形瓶中，再次移取20 mL 乙酸乙酯加入離心管剩余殘渣中，重復(fù)提取一次，把兩次提取液合并放入100 mL梨形瓶中。

（2）凈化。將4 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸溶液加入100 mL 梨形瓶中，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（設(shè)定溫度40 ℃）下濃縮。當(dāng)梨形瓶內(nèi)的提取液量減少到3 mL 時，將剩余的液體轉(zhuǎn)入10 mL離心管中。在離心管中加入2 mL 0.1 mol·L-1的鹽酸溶液，用3 mL 正己烷沖洗梨形瓶，將洗液也倒入10 mL 離心管內(nèi)。經(jīng)過旋渦混合30 s 后，在3 000 r·min-1下離心5 min，棄去上層的正己烷。再用3 mL 正己烷沖洗梨形瓶，并將洗液轉(zhuǎn)入10 mL 離心管，進(jìn)行旋渦混合30 s。離心條件同上，棄去上層的正己烷，下層液體留作后續(xù)使用。以2 mL 甲醇和2 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液活化MCX 柱。將備用液通 過MCX 柱，流速控制在1 mL·min-1，用1 mL 0.1 mol·L-1鹽酸溶液和2mL 50%甲醇乙腈溶液分別淋洗并吹干MCX 柱。使用4 mL 洗脫液收集MCX 柱中保留的磺胺類藥物，再在40 ℃的氮氣環(huán)境下吹干。在刻度離心管中加入1mL 0.1%甲酸乙腈溶液以溶解殘留物，用0.45 μm 有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾，準(zhǔn)備后續(xù)測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線性范圍

把8 種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)混合液分別配制成濃度為0.03 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.07μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.30 μg·mL-1、0.40 μg·mL-1和0.50 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用1.3.2 的色譜條件選取兩組濃度范圍進(jìn)行分析測定。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)（μg·mL-1），以實驗測得的峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，如表2 所示。8 種目標(biāo)化合物的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，表明8 種磺胺類藥物在0.03～0.20 μg·mL-1、0.10～0.50 μg·mL-1內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

表2 化合物線性范圍表

2.2 方法檢出限測試

由2.1 得出結(jié)論，8 種磺胺類藥物在0.03～0.20 μg·mL-1，藥物濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。按信噪比（S/N）為3 確定本方法的檢出限為10 μg·kg-1。

2.3 方法精密度測試和準(zhǔn)確度測試

稱取兩組豬肉樣品，每組6 份豬肉，每份豬肉樣品在（5±0.05）g，向第一組豬肉樣品中分別加入0.05 mL 1.0 μg·mL-1濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液，平行測定6 次，向第二組豬肉樣品中分別加入0.175 mL 1.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合液，平行測定6 次，計算得到豬肉樣品的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3 所示。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～6.7%，回收率為61.00%～95.40%，符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中13 種磺胺類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法》（GB 29694—2013）中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%、樣品回收率在60%～120%的要求，說明本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3 方法精密度與加標(biāo)回收率測定數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜法-紫外檢測法，對豬肉樣品中8 種磺胺類藥物殘留進(jìn)行測定，通過選擇適宜的樣品處理方法，合理的儀器分析條件，能夠準(zhǔn)確檢測出8 種磺胺類藥物的殘留。該方法的檢出限為10 μg·kg-1，精密度在1.3%～6.7%，樣品平均加標(biāo)回收率在61.00%～95.40%。綜上所述，該分析方法適用于豬肉樣品中8 種磺胺類藥物殘留的同步檢測。