生態因子對三葉木通和五葉木通居群遺傳多樣性的影響

湯騰躍，余柯達，王佳淇，范超洋

(1.金華市婺城區雅畈鎮人民政府，浙江 金華 321000；2.浙江師范大學，浙江 金華 321004；3.上海新紀元武義高級中學，浙江 金華 321017；4.金華先實大農業科技有限公司，浙江 金華 321004)

三葉木通和五葉木通同屬木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia)，是營養價值和藥用價值極高的藤本植物[1]。五葉木通屬落葉或半常綠木質藤本，俗稱木通，在我國野生資源豐富，是我國的傳統中草藥，具有抗癌、抗炎、抗菌、利尿、止痛、抗風濕等功效。三葉木通俗稱八月炸、金腎果、野香蕉，果實是中藥預知子。在我國分布廣泛，其果實味香甘甜，風味獨特，營養豐富，富含維生素C(VC)、17種氨基酸、礦物質、脂肪酸、蛋白質、糖和微量元素等，是名副其實的第3代保健型野生水果[2]。然而野生木通資源匱乏，人工培育顯得尤為重要。

目前的研究[3-5]表明，溫度是影響三葉木通生長的第一要素，光照是次要因素，海拔和坡度是決定三葉木通群落分布的主要因子，土壤性質對三葉木通的生長也存在著一定的影響。有關木通的遺傳多樣性研究相對較少，其中席在星[6]建立了三葉木通隨機擴增多態性DNA(RAPD)最佳反應體系；田宗城等[7]用RAPD技術對木通屬4個種進行研究，發現七葉木通與三葉木通種的親緣關系較遠，而白木通與三葉木通的親緣關系較近；Kitaoka等[8]以三葉木通葉片為材料，建立適合三葉木通種質資源遺傳多樣性研究的優化AFLP反應體系。目前還沒有關于生態因子影響木通遺傳多樣性的研究。

nrDNA的轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)承受的選擇壓力較小，具有很高的可變性，且在核基因組中高度重復。ITS區的可變性為物種鑒定提供了豐富的變異位點和信息位點。Zietkiewicz等[9]發現，五葉木通ITS序列不具有獨立性。ISSR標記是1994年開始發展起來的一種分子標記技術[10]，結合了SSR和RAPD的優點，目前已廣泛應用于遺傳多樣性、進化及分子生態學等研究中。本實驗結合ITS序列分析和ISSR標記2種方法探究生態因子對三葉木通和五葉木通遺傳多樣性的影響，為保護浙江三葉木通和五葉木通種質資源，提供基礎資料和科學依據，也為三葉木通和五葉木通的人工培育提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對浙江省三葉木通和五葉木通主分布區內的天然種群做了采樣分析，包括金華北山(Bs)、開化古田山(Gt)、磐安大盤山(Pa)、泰順烏巖嶺(Wy)、杭州西天目山(Xt)、溫州雁蕩山(Yd)和麗水龍泉市(Zs)7個地區的三葉木通、五葉木通樣本，共34個樣品，各樣地的三葉木通和五葉木通種群之間呈相對隔離狀態。采樣時，采摘三葉木通和五葉木通的嫩葉放于保鮮袋中，封口，置于樣品貯藏箱(用冰塊保持冷藏條件)帶回實驗室，-80 ℃低溫冰箱保存。同時采集各種群距地表2～10 cm深的土壤，供土壤分析用。樣品采集地點、樣品編號等具體信息見表1。

表1 樣品采集具體信息Table 1 Sample collection information

表2 五葉木通不同居群ITS序列的遺傳距離Table 2 Genetic distance of ITS sequences in different populations of Akebia quinata

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

參考張錚等[10]改良CTAB法提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取的樣本基因組DNA質量，并置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 ITS序列擴增和測序

采用引物ITF1(5′-GCTCCTACCGATTGAATGGT-3′)和ITR1(5′-GTAAGTTTCTTCTCCTCCGC-3′)，擴增木通樣本的ITS序列。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環。擴增反應體系為25 μL，含2.5 μL 10×ExTaqPCR Buffer、70 ng模板DNA、0.2 mmol·L-1dNTP、0.4 μmol·L-1ITF1、0.4 μmol·L-1ITR1、0.75 U ExTaqDNA聚合酶(寶生物工程大連有限公司)。PCR產物采用上海生工DNA柱式通用回收試劑盒進行回收，10 μL回收產物送至生工生物(上海)公司進行測序，對所有序列均進行雙向測序。

1.2.3 ISSR擴增及電泳分析

根據加拿大哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。對木通屬ISSR-PCR反應體系進行了優化，確定了最佳的反應條件為：反應體系為25 μL，其中2.5 μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、70 ng模板DNA、0.15 mmol·L-1dNTP、引物濃度0.4 μmol·L-1、0.5 mmol·L-1Mg2+、0.75 U rTaqDNA聚合酶(寶生物工程大連有限公司)；PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，退火45 s(退火溫度隨引物而定)，72 ℃延伸90 s，共35個循環。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像分析系統拍照保存。

1.3 數據分析

1.3.1 ITS數據分析

對測序公司返回的ITS序列，用ClustalW 2軟件進行序列比對。序列使用MEGA 5.0分子進化遺傳分析軟件構建發育樹，發育樹各分支的置信度用自舉檢驗法檢驗，共進行500次循環，以評價各分支的系統學意義與可靠性。

1.3.2 ISSR數據分析

在電泳圖譜上的每一個條帶均視為一個分子標記，代表1個引物的結合位點。按凝膠同一個位置上DNA帶的有無進行統計，有帶的記為1，無帶的記為0，生成0/1 Excel統計表。采用POPGEN 32軟件計算多態位點百分數(P)、Shannon′s信息指數(I)和Nei′s基因多樣性指數(h)來估算基因多樣性[11]。利用SPSS 16.0軟件導入0/1 Excel統計表計算樣品遺傳相似系數和遺傳距離，并按UPGMA法(非加權配對算術平均法)對所有樣品進行聚類分析，構建親緣關系圖。

2 結果與分析

2.1 ITS序列分析

2.1.1 ITS聚類分析

用最大似然法(ML法)構建ML系統發育樹(圖1)，用bootstrap自舉法檢驗發育樹，重復500次，判斷各分支處的可信度。

圖1 基于ITS序列構建的27個樣本ML系統發育樹Fig.1 A phylogenetic tree of 27 samples of ML based on ITS sequences

在聚類圖中，三葉木通和五葉木通大致各自聚為一支，而Pa6w樣本與三葉木通聚為一類，在三葉木通一類中與其他樣本遺傳距離較遠。由葉形觀察知，Pa6w樣本為五小葉復葉，而葉片大小、葉緣和長寬比與三葉木通相近，因此推斷，Pa6w樣本可能是三葉木通和五葉木通的過渡類型。從ML聚類圖看出，三葉木通樣本間的聚類結果支持率十分低，其聚類結果可信度不高，說明不同地區三葉木通的ITS序列間變異不大，遺傳距離過小，不適合采用ITS序列來分析它們之間的親緣關系。相反，五葉木通的聚類結果支持率較高，可以采用ITS序列來分析樣品之間的親緣關系。

2.1.2 海拔與五葉木通遺傳多樣性具有明顯相關性

五葉木通某些樣品無法采集土樣，未能測定其pH值和有機質含量。利用MEGA 5.0軟件計算遺傳距離(表2)可知，五葉木通不同居群間ITS堿基序列的遺傳距離在0～0.007 8，與其他物種相比，種內ITS序列的變異范圍較小。在ML系統發育樹中，Xt6w和Xt9w的海拔高度差距最小，兩者之間的遺傳距離也最短，而Xt5-2w雖然也采自西天目山地區，但并沒有與Xt6w和Xt9w聚為一支，可能是由于其海拔較高。計算海拔與樣本遺傳距離間的相關系數，得出r海拔=0.96，遠大于0.8，相關性顯著。總體而言，隨著居群之間海拔高度差距的增加，其遺傳距離也相應增大，說明海拔對五葉木通的遺傳多樣性產生一定的影響。

2.2 ISSR分析

2.2.1 ISSR引物篩選結果

通過ISSR技術對三葉木通進行遺傳多樣性分析，從75對引物中篩選出15對擴增條帶多、清晰且重復性好的引物用于ISSR-PCR反應(表3)。經統計，這15對引物擴增共得到265條帶，其中多態性條帶為261條，占比98.49%。擴增的DNA片段長度介于200～2 000 bp。

表3 篩選出的15條ISSR引物Table 3 Fifteen screened ISSR primers

2.2.2 三葉木通遺傳多樣性

各地區樣本的多態位點百分率存在著差異，古田山地區最高，北山地區最低，變化范圍在49.26%～70.32%，平均為61.42%。各地區三葉木通的Shannon′s信息指數(I)變化范圍在0.212 2～0.605 9之間，平均為0.394 0。Nei′s基因多樣性指數(h)的大小為0.250 0～0.367 3(表4)。P、h和I都顯示出三葉木通樣本具有較高的遺傳多樣性(圖2)。

圖2 UBC818 ISSR-PCR擴增電泳圖Fig.2 ISSR-PCR amplification electropherogram of UBC818

表4 不同地區三葉木通的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Akebia trifoliata in different regions

2.2.3 ISSR聚類分析

運用SPSS 16.0對6個地區的23個三葉木通樣本進行UPGMA聚類分析，得到樹狀聚類分析圖(圖3)。從圖3可以得出，當遺傳距離為13時，每個地區的三葉木通樣本各自聚為一類；當遺傳距離為18時，烏巖嶺、西天目山、雁蕩山的樣品和北山、古田山、大盤山的樣品區分開來；當遺傳距離為25時，三葉木通和參照樣本(鷹爪楓)區分開來。這表明同一個地區三葉木通其遺傳差異小于不同地區間三葉木通的差異。

圖3 23個三葉木通樣本UPGMA聚類樹狀圖Fig.3 UPGMA cluster dendrogram of 23 Akebia trifoliata samples

2.2.4 海拔、土壤有機質含量和pH值與三葉木通遺傳多樣性的相關性不顯著

從三葉木通的聚類分析結果可知，三葉木通的聚類與區域有關，每個地區的三葉木通各自聚為一類。三葉木通樣本取自浙江省6個不同的地區，所生長的生境有著一定的差異，結合生境中的土壤pH值、有機質含量和海拔這3個生態因子，計算三者與遺傳距離的相關系數，得出r海拔=0.03，rpH值=0.22，r有機質含量=0.02，相關系數r遠小于0.8，這表明海拔、土壤的酸堿度和有機質含量對三葉木通的遺傳多樣性影響不大。

3 討論

3.1 海拔與五葉木通遺傳多樣性相關性分析

研究結果表明，海拔與五葉木通的遺傳多樣性有一定的相關性。五葉木通性喜溫暖濕潤氣候，不耐嚴寒，多生長在海拔50～1 200 m的山地灌叢、林緣和溝谷中，其中又以海拔200～900 m分布較為豐富[12]，推測該海拔高度范圍較適宜五葉木通生長，受到的生境選擇壓力較小，從而影響其遺傳多樣性。

海拔因素對五葉木通遺傳多樣性的影響，初步說明了海拔對基因交流存在一定的阻礙作用；而海拔相近的五葉木通居群，如Xt6w和Xt9w遺傳距離較小，可能是小范圍內生境類型大致相同造成的。由于海拔差距的存在，導致物種不同居群間親緣關系發生變化的現象，在皮樺[13]和水稻[14]中也有報道。海拔的變化常常是決定物種生境差異的主導因子，可能還伴隨著溫度、降水、光照和土壤等生態因子的改變，進而影響植物的分布和遺傳多樣性[15]。

3.2 地區差異與三葉木通遺傳多樣性相關性分析

利用ISSR技術對浙江省6個不同地域的三葉木通種群遺傳多樣性進行分析，其物種水平的多態位點百分率(P)高達98.49%，Nei′s基因多樣性指數(h)為0.503 3，Shannon′s信息指數(I)為0.689 0，反映出三葉木通的遺傳多樣性較高。影響種群遺傳分化的因素很多，如繁育系統、分布范圍、種子傳播機制和演替階段等[16-19]。在UPGMA方法構建的系統樹狀圖中，各三葉木通間是按照浙江省內的金華北山、開化古田山、磐安大盤山、泰順烏巖嶺、臨安西天目山和溫州雁蕩山6個地區進行聚類的，說明三葉木通間的遺傳變異程度與地域分布有一定相關性，其原因可能是地理阻隔導致遺傳組成發生了變異，地理環境是造成該植物遺傳多樣性的重要因素[20]。