果膠污泥的基質化開發及其在育苗中的應用

葉楠，王翹楚，徐世豪，于建興，洪基光，李加友*

(1.嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001；2.象山華宇食品有限公司，浙江 寧波 315700)

我國是世界上最大的柑橘罐頭生產國和出口國，罐頭加工有利于解決柑橘集中上市銷售困難的問題，是柑橘深加工的主要途徑。柑橘罐頭加工過程中產生的廢水中含有大量果膠，影響廢水的好氧生化處理，因此，生產企業通常采用混凝吸附法或復合絮凝劑處理法將廢水中的果膠絮凝沉降，然后分離出果膠污泥[1-3]。但是，果膠和復合絮凝劑形成的高分子網絡結構，吸水能力強，果膠污泥含水量可達到80%～90%[4-5]，厭氧消化、填埋和焚燒的成本都很高，給生產企業和行業發展都帶來重大影響[6-8]；如果廢棄或自然放置，果膠污泥對土壤、空氣和水體都會造成二次污染[9]。

本研究中擬將果膠污泥與秸稈、蛭石等輔料混合后，利用高性能的微生物菌株進行好氧發酵，將混合基料快速轉化成一種新型栽培基質，實現果膠污泥的資源化利用，具有良好的經濟可行性。基質化開發為柑橘罐頭加工企業的果膠污泥開辟了一條新的利用途徑，為產業可持續發展提供了新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

果膠污泥：象山華宇食品有限公司提供；水稻秸稈：嘉興市歸源農業技術開發有限公司提供；蛭石：新疆尉犁新隆蛭石有限責任公司提供。

基礎培養基(PDA培養基)：土豆200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然(固體培養基另加瓊脂15 g)。

篩選培養基[10]：果膠5.0 g、七水硫酸鎂2.0 g、硫酸鐵0.01 g、磷酸二氫鉀0.5 g、氯化銨0.4 g、氯化 1 g、硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、溴酚藍0.1 g、瓊脂15 g、水1 000 mL。

HWS-450智能恒溫恒濕培養箱：常州杰博森儀器有限公司；LDZX-50KBS型50立升(手輪型)立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；TD4臺式低速離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司；756 s紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；YJ-840/YJ-1340潔凈工作臺YJ型：蘇州蘇信環境科技有限公司。

1.2 果膠降解菌的篩選

1.2.1 果膠污泥的自然發酵

將果膠污泥分別與秸稈、蛭石混合，在自然狀態下進行發酵，具體操作：分別將果膠污泥與秸稈、蛭石混合，果膠污泥占比分別為90%、85%、80%、75%、70%，每個處理3個重復，在28 ℃條件下自然發酵5 d；發酵過程中觀察微生物的生長情況。果膠含量利用咔唑比色法測定[11]。

1.2.2 果膠降解菌的分離篩選

將發酵料上長勢良好的菌株，在超凈臺內，用平板劃線法分別接種在PDA培養基上，在恒溫培養箱中28 ℃培養觀察，進一步分離純化，獲得單菌落后保藏。

將PDA培養基中純化得到的菌種分別接種到篩選培養基上，在28 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d后根據培養基中溴酚藍的顏色變化和菌落形態，對所純化菌株的果膠降解性能進行定性比較。果膠酶活力以DNS法測定[12-13]。

1.3 栽培基質的混合發酵制備方法

基于秸稈和蛭石的吸水能力不同，分別按照果膠與秸稈4∶1、果膠與蛭石3∶1配制發酵原料，然后每個處理加入5 mL菌液，放置在溫度為28 ℃的通風環境中進行發酵。發酵過程中定期檢測體系的果膠含量，當果膠含量不再下降時發酵結束，烘干后制得成品的栽培基質。

1.4 育苗試驗

櫻桃紅蘿卜品種為上海小紅蘿卜，菠菜品種為華波1號，四季小香蔥品種為魯蔥1號。稱取栽培基質2 g，將約3/4的栽培基質加入育苗盤的穴中，然后每一穴中播入1粒種子。播種完成后將剩余栽培基質覆蓋種子之上，澆水浸透。

在20 ℃下培養發芽，覆上保鮮膜保溫，待發芽后去掉保鮮膜。在每天9：00-11：00和15：00-17：00補充自然光照；每2 d澆一次水，并統計發芽率和觀察幼苗長勢。苗齡10 d起，每隔3 d從每組處理中隨機抽取幼苗15株，測定株高、鮮重、干重等指標，平行測定3次。其中，株高為根莖部到生長頂部間的長度，用直尺測量；60 ℃烘干至恒重測定其干重[14-18]。

2 結果與分析

2.1 果膠降解菌的篩選

測定混合物發酵前的果膠濃度，每隔10 d為一批次，分批次再次測定樣品中的果膠濃度以確定發酵是否結束。當果膠濃度不再降低時即為發酵結束。結果(圖1)表明，經過30 d的發酵，果膠發酵完全結束。

圖1 果膠降解菌株康寧木霉LZ51菌落形態Fig.1 Colony morphology of the pectine-degrading strain Trichoderma koningii LZ51

用2倍體積的水浸泡發酵完成的基質，收集浸泡液得果膠酶液，用DNS法測定不同處理中的果膠酶活性[19-21]。結果表明，從秸稈果膠泥混合基質篩選獲得的菌株LZ51產生果膠酶活性最強，達到684 U·mL-1。經分子生物學鑒定(圖2、表1)，該菌為康寧木霉(Trichodermakoningii)。該菌株保藏備用。

表1 18S rDNA BLAST比對結果Table 1 Results of the 18S rDNA BLAST alignment

圖2 菌株康寧木霉LZ51的18S rDNA電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 18S rDNA of the strain Trichoderma koningii LZ51

2.2 不同基質對三種菜種發芽率的影響

利用秸稈果膠基質(M1)、蛭石果膠基質(M2)和蛭石基質(CK)等三種不同基質分別栽培櫻桃紅蘿卜、大葉菠菜和四季香蔥，考查果膠污泥發酵基質對不同蔬菜發芽的影響。由圖3～5可知，秸稈果膠基質中幼苗的生長情況穩定，3種幼苗的發芽率較蛭石果膠基質平均高3%，較蛭石基質平均高5%。且蛭石基質在生長過程中出現了幼苗感染病菌出現倒伏的情況，說明秸稈果膠基質和蛭石果膠基質經過發酵處理，有一定的抗病菌能力，增強了蔬菜幼苗的抵抗力。

圖3 不同基質對櫻桃紅蘿卜發芽率的影響Fig.3 Effects of different substrates on germination rate of cherry red radish

在櫻桃紅蘿卜的育苗實驗中(圖3)，3種基質的幼苗發芽率相差在3%左右，櫻桃紅蘿卜與另兩種蔬菜的不同之處在于，大葉菠菜與四季香蔥屬于葉菜類蔬菜，櫻桃紅蘿卜屬于根菜類蔬菜。對于基質的疏松性、保水性、通透性等也有不同的要求；四季香蔥的育苗結果表明(圖4)，蛭石基質的平均發芽率較秸稈基質高出2%；大葉菠菜的發芽率中，秸稈果膠基質比蛭石果膠基質、蛭石基質分別高出2%和3%(圖5)。

圖4 不同基質對四季香蔥發芽率的影響Fig.4 Effects of different substrates on the germination rate of four-season chive

圖5 不同基質對大葉菠菜發芽率的影響Fig.5 Effects of different substrates on germination rate of large-leaf spinach

綜上所述，秸稈果膠基質和蛭石果膠基質對于3種蔬菜的發芽率較蛭石基質明顯提升。因此，利用秸稈或者蛭石和果膠污泥混合后進行發酵處理，所制備的基質有利于蔬菜種子的發芽。

2.3 不同基質對蔬菜幼苗生長的影響

在幼苗培育10 d之后開始每隔3 d進行一次株高的測量。測量時，從每個穴盤內隨機選取15株，測量其絕對株高。選取測量株高的植株時，不選取邊際植株。

由表2可知，蛭石果膠基質培育的四季香蔥幼苗長勢更好，在13 d時四季香蔥幼苗株高已經達到了6.77 cm，生長速度很快。而秸稈果膠基質對于3種蔬菜的生長都有明顯的促進作用，秸稈基質中的菜苗平均以0.3 cm·d-1的速度生長，且秸稈果膠基質培育的菜苗均未出現幼苗倒伏的情況，而其他兩種基質均有幼苗倒伏。

表2 不同基質對蔬菜幼苗株高的影響Table 2 Effects of different substrates on plant height of vegetable seedlings 單位：cm

由圖6可知，秸稈果膠基質培育的櫻桃紅蘿卜鮮重較其他兩種基質增加30%以上，培育的大葉菠菜鮮重和蛭石果膠基質相近，較蛭石基質有了約50%的提升；但是，秸稈果膠基質和蛭石果膠基質培育的四季香蔥鮮重均不及蛭石基質。

圖6 不同基質對培育蔬菜幼苗鮮重的影響Fig.6 Effects of different substrates on fresh weight of vegetable seedlings

3 總結與討論

篩選出的菌株康寧木霉LZ51具有較強的果膠轉化能力，在果膠污泥和秸稈混合發酵基質中的果膠酶活性為684 U·mL-1，產酶能力較強。

蛭石是最常用的栽培基質之一，果膠污泥分別與秸稈、蛭石混合發酵制得的育苗基質在櫻桃紅蘿卜、大葉菠菜和四季香蔥的試用中發現，3種蔬菜的種子發芽率、幼苗株高、鮮重等生長指標方面均表現出良好效果，性能較蛭石基質優良；尤其是秸稈與果膠污泥混合基質中，3種幼苗的發芽率較蛭石基質平均高5%。

綜上所述，秸稈果膠混合發酵生產的栽培基質在蔬菜育苗中具有良好的應用前景；基質化利用為解決柑橘罐頭加工企業的果膠污泥難題開辟了一條新途徑，為果膠污泥的資源化利用奠定了基礎，對行業可持續發展具有重要價值。