慢病毒介導的穩定表達鴨干擾素-γ細胞株的構建

陳柳，倪征，劉可姝，葉偉成，華炯鋼，云濤，朱寅初，張存

(浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021)

干擾素(interferon，IFN)是細胞因子之一，具有免疫調節功能和廣譜抗病毒活性，參與機體天然抗病毒免疫。它是一種誘生蛋白，在正常細胞中其基因處于抑制狀態，當細胞受到病毒、細菌感染和某些化合物質等外界刺激激發后，干擾素基因會被激活而表達。根據其作用，干擾素分為Ⅰ型和Ⅱ型干擾素。Ⅰ型干擾素是IFN-α和IFN-β，抗病毒作用強。Ⅱ型主要是指IFN-γ，由活化的T細胞、NK細胞等產生。IFN-γ廣泛地參與調控天然和適應性免疫反應。具有多種生物功能，包括抗病毒、抗腫瘤和免疫調節等活性，促進巨噬細胞活化、促進抗原的加工和遞呈，調控T細胞等生長分化。與IFN-I相比，其免疫調節活性更為突出[1]。近年來的研究發現，IFN-γ在免疫調節異常導致的自身免疫性疾病中起著非常關鍵的作用；除了參與調節免疫反應外，還參與調控自噬的發生和造血干細胞的功能[2]。IFN具有較強的種屬特異性。目前，用于人、哺乳動物和嚙齒類動物的干擾素研究比較深入，且部分產品已在臨床上廣泛應用。但由于禽類干擾素與其他種屬的同源性較低，適用于其他種屬，尤其是人類IFN的研究方法不太適合于禽類。因此，其研究相對滯后。迄今為止，鴨IFN-γ已被嘗試在多種表達系統中進行了表達，如畢赤酵母[3]、昆蟲桿狀病毒表達系統[4-5]、原核表達系統和真核系統[6-10]，并被證實有抗病毒活性。此外，IFN-γ還常常被研發為疫苗佐劑[10-14]。

雖然已有人開展鴨IFN-γ的研究，但目前對于鴨IFN-γ功能了解仍甚少，且鴨IFN-γ診斷試劑和鴨(禽)用干擾素產品缺乏。為了開展這方面的研究，本研究利用慢病毒系統構建了表達鴨IFN-γ的慢病毒，將該病毒接種CHO細胞，通過加壓篩選獲得了一株穩定表達duIFN-γ的CHO細胞系。該研究為闡明duIFN-γ的功能、建立duIFN-γ診斷技術或未來將其應用于禽類養殖業疾病的治療或預防奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和細胞

質粒plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro購自ABM生物科技有限公司，質粒pET30a(+)、慢病毒包裝細胞系293T細胞、CHO細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

DNA ladder Marker、Taq聚合酶、dNTP、限制性內切酶、Tranzyme cloning kit、2nd Generation Packaging System Mix、LentifectinTMTransfection Reagent、嘌呤霉素、ExCellenCT Lysis Kit、5×All-In-One RT MasterMix、EvaGreen 2×qPCR MasterMix、慢病毒滴度檢測試劑盒皆購于ABM生物科技有限公司，質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于Omega公司。DMEM培養基、胎牛血清FBS購自Gibcol，D-tag抗體購于Abcam。Western Blot Chemiluminescence HRP Substrate化學發光底物購自于寶生物工程(大連)有限公司；酶標二抗(HRP標記的山羊抗小鼠IgG)購于Santa Cruz公司。

1.3 重組質粒的構建

參考鴨IFN-γ序列(GenBank登錄號：AF087134)，委托金斯瑞生物科技有限公司進行密碼子優化，并合成IFN-γ，羧基端添加1×Flag標簽。將合成片段通過酶切、連接，用Tranzyme cloning kit將IFN-γ片段克隆于pORF質粒。PCR篩選及測序分析獲得陽性質粒。然后將IFN-γ基因亞克隆至pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro 載體。通過EcoR V酶切鑒定，篩選陽性克隆plenti-IFN，測序驗證。委托金斯瑞生物有限公司合成IFN-γ序列，分別在5′和3′端引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點。通過引入的酶切位點將IFN-γ基因亞克隆至pET30a(+)質粒。通過PCR、測序篩選獲得陽性克隆pET30-IFN。

1.4 慢病毒包裝

轉染前2 d將293T細胞傳代于10 cm細胞板，板內加入10 mL完全培養基(含10% FBS的DMEM培養基)，轉染時細胞達到70%～80%融合率為佳。依照LentifectinTMTransfection Reagent試劑盒操作手冊進行轉染，將10 μg plenti-IFN表達質粒和10 μg的慢病毒轉染輔助質粒2nd Generation Packaging Mix，混勻，室溫孵育5 min。同時設立空載體作為空白對照組(10 μg pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro和10 μg的慢病毒轉染輔助質粒2nd Generation Packaging Mix)。將80 μL的Lentifectin轉染試劑稀釋到1 mL無血清培養基中，混勻，室溫孵育5 min。將2組Lentifectin混合溶液分別加到質粒混合溶液中，混勻，室溫孵育20 min后，再加入4.5 mL的無血清培養基，即得到混勻的DNA/LentiFectin混合物。將混合物分別加入棄掉培養基的293T細胞中，輕柔渦旋平板使復合物分散。之后置于CO2培養箱培養。8～14 h之后，更換為維持培養基(含2%～5% FBS的DMEM培養基)繼續培養。48 h之后收集培養基，以0.45 μm的低蛋白結合PES過濾膜過濾該培養基得到純化的病毒液。將收集的病毒液10 000 r·min-1離心4 h，即可獲得濃縮的慢病毒rlenti-IFN和對照病毒rlenti-CN。

1.5 病毒滴度測定

根據Abm慢病毒滴度檢測試劑盒說明用熒光定量法測定病毒滴度。吸取2 μL稀釋好的病毒樣品，加入18 μL的病毒裂解緩沖液并在室溫下孵育3 min。病毒裂解物的Ct值將用于確定未知病毒樣品的滴度。使用qRT-PCR法測定，反應體系為：2×qPCR MasterMix 12.5 μL，病毒裂解液2.5 μL，Reagent-mix 10 μL。同時設置標準物1(STD1)、標準物2(STD2)、陰性對照(NTC)。反應程序為2 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。計算出病毒滴度。

1.6 病毒感染及穩定細胞系篩選

1.6.1 藥篩濃度確定

接種CHO細胞于24孔板，細胞密度為20%～35%，設置5個實驗組，分別加入濃度為0、2、4、6、8 μg mL-1的嘌呤霉素。將細胞放于CO2培養箱中培養，每天觀察細胞死亡情況。每2～3 d更換1次同樣濃度的篩選培養基。7 d后觀察細胞死亡情況，初步確定嘌呤霉素的濃度范圍。之后按照同樣的方法操作，將嘌呤霉素濃度調整為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 μg·mL-1，確定最終的嘌呤霉素濃度。

1.6.2 慢病毒感染

將CHO細胞提前24 h接種于24孔板中，保證感染時細胞達到20%～35%的融合密度。將rlenti-IFN按照MOI=50的病毒量接種細胞，72 h后觀察細胞生長狀態。加入確定濃度的嘌呤霉素進行藥篩。每天觀察細胞死亡情況。每2～3 d更換一次篩選培養基。持續培養直至篩選出具有嘌呤霉素抗性的細胞。

1.6.3 細胞單克隆挑選

待出現一些具有抗性的細胞克隆后。停藥培養，使其逐漸增大。之后將該細胞克隆用胰酶消化，然后采用有限稀釋法傳至96孔板，觀察96孔板中的細胞，將只有單個細胞的孔做好標記，用含15%的胎牛血清的完全培養基擴大培養。觀察1周后，挑選出生長較好的單克隆細胞系，編號。然后對其擴大培養，用RT-qPCR方法檢測IFN-γ的表達情況，挑選出過表達效果最好的一孔，進行擴大培養成穩定細胞系CHO-IFN。

1.7 RT-qPCR檢測duIFN-γ轉錄水平

離心收集CHO-IFN細胞。根據ExCellenCT Lysis Kit細胞裂解試劑盒操作手冊裂解細胞，提取RNA。之后參考5×All-In-One RT MasterMix試劑盒說明書進行反轉錄，采用EvaGreen 2×qPCR MasterMix(Cat.No.MasterMix-R)熒光定量試劑盒檢測穩定轉染細胞系CHO-IFN中IFN-γ的表達。所用引物如下：IFN-gammaF(5′-TGTTCGTCCTC TCTGTGATC-3′)，IFN-gammaR(5′-GGTCTTCTTG AGCATTTCG-3′)；內參基因引物β-actinF(5′-GATTCCTATGTGGGCGAC-3′)，β-actinR(5′-TTGTAGAAGGTGTGGTGCC-3′)。PCR反應體系如下：EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.6 μL，模板DNA 2 μL，加無核酸酶H2O至終體積20 μL。擴增程序為95 ℃預變性10 min；96 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共25個循環。

1.8 duIFN-γ多克隆抗體的制備

將重組質粒pET-IFN轉化至表達菌株BL21(DE3)/Plys，誘導表達。按照常規方法大量誘導表達及純化蛋白，免疫小鼠制備多克隆抗體。

1.9 Western blot法檢測duIFN-γ的表達

收獲CHO-IFN細胞和空白對照CHO-Lenti-CN細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10% SDS-PAG凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉30 min，一抗為D-Tag或IFN-γ多抗，稀釋比例分別為1∶1 000、1∶500，37 ℃孵育1 h，PBST(Tween20，0.5%)洗滌3次，每次5 min，二抗稀釋比例1∶5 000，37 ℃孵育1 h，PBST(Tween20，0.5%)洗滌3次。徹底洗膜后使用ECL發光試劑顯影，曝光。

2 結果與分析

2.1 重組載體的酶切鑒定

抽提陽性質粒plent-IFN，用EcoR V進行酶切、電泳鑒定。結果如圖1所示，重組質粒按照預期切出了8.8和0.7 kb 2條帶。

圖1 重組plenti-IFN質粒的EcoR V酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plenti-IFN by EcoR V digestion

2.2 細胞轉染及克隆篩選

將plenti-IFN質粒和慢病毒轉染輔助質粒轉染至慢病毒包裝細胞系293T細胞，于72 h觀察，拯救出了具有嘌呤霉素抗性的帶有GFP標記的重組病毒rlenti-IFN(圖2中a和b)。

a、b-重組病毒rlenti-IFN；c-細胞克隆。圖2 重組慢病毒rlenti-IFN感染的CHO細胞Fig.2 CHO cells infected with rlenti-IFN

繼而結合有限稀釋法，以最適濃度為5 μg·mL-1的嘌呤霉素對rlenti-IFN感染細胞進行加壓篩選，獲得一系列病毒穩定感染的細胞克隆(圖2中c)。

2.3 RT-qPCR檢測duIFN-γ基因的表達

使用RT-qPCR法對篩選到的30個單克隆細胞系中IFN-γ基因的mRNA水平進行測定，最終篩選到了一株IFN-γ過表達倍數高達84.45的單克隆細胞株clone19。確定該單克隆細胞株為目的細胞株。

2.4 Western blot檢測duIFN-γ蛋白表達

收獲過表達倍數最高的CHO-IFN細胞及對照細胞CHO-Lenti-CN，分別以D-tag抗體和鼠抗IFN多抗為一抗，進行Western blot檢測，結果表明，CHO-IFN細胞樣品在約24 ku處顯出特異性條帶(圖3)，且目標蛋白能被D-taq抗體和IFN-γ抗體同時識別，說明蛋白按照預期進行了表達。

1-對照，CHO-lenti-CN細胞；2-CHO-IFN細胞。圖3 Western blot方法檢測穩定細胞系CHO-IFN中IFN-γ的表達Fig.3 Detection of IFN-γ expression in stable cell line CHO-IFN by Western blot

3 結論與討論

哺乳動物的IFN-γ研究得比較透徹，然而禽類IFN-γ與哺乳動物的同源性較低，只有21%～34%。而雞與鴨的IFN-γ核苷酸序列同源性高達80%。因此，哺乳動物上的研究結果借鑒度不高，而禽類IFN-γ基因編碼區保守度高，在干擾素研究過程中可以相互借鑒。鴨IFN-γ先后在多個表達系統進行了表達，且被證明有抗病毒活性。這為我們構建穩定細胞系提供了理論依據，構建穩定轉染細胞系，慢病毒介導外源基因的整合是較為常見的方法之一。該系統可以將攜帶的外源基因導入并整合至宿主細胞基因組，并能長期穩定表達。慢病毒感染能力強，能有效地感染神經元細胞、心肌細胞、肝細胞、干細胞、內皮細胞、腫瘤細胞等多種類型的細胞。慢病毒載體系統已廣泛應用于構建過表達外源基因細胞系[15]、基因沉默或敲除細胞系[16-17]、轉基因動物[18]，甚至用于將基因靶向組織和器官等進行基因治療[19-21]。目前，采用的慢病毒為復制缺陷型病毒，不存在生物安全性的問題。

IFN-γ為糖基化蛋白，有復雜的結構，通過形成同源二聚體發揮生物學功能。因此，在哺乳動物細胞系統表達的IFN-γ較原核系統、昆蟲-桿狀病毒系統更具有形成天然IFN-γ的可能性。內源性IFN-γ表達水平往往能從側面反映機體的細胞免疫狀態，因此，檢測IFN-γ常作為診斷某些病原感染的輔助手段，且在免疫學基礎研究中得到了廣泛應用。本研究利用慢病毒系統將外源基因鴨IFN-γ穩定轉染至CHO細胞，通過抗性篩選獲得了一株穩定表達IFN-γ的CHO-IFN細胞株，該研究為duIFN-γ的擴大培養、功能研究、duIFN-γ診斷方法的研發和廉價鴨(禽)用干擾素的生產奠定了基礎。