黃芩素對SCC15口腔癌細胞增殖和Caspase-3活性的影響

黃芩素對SCC15口腔癌細胞增殖和Caspase-3活性的影響

翟越趙海豐1

(燕山大學校醫院，河北秦皇島066004)

摘要〔〕目的探討黃芩素(BAI)對人口腔癌細胞株 SCC15增殖和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3活性的影響。方法以噻唑藍比色法(MTT)檢測BAI在不同濃度(終濃度的50、100、200 μg/ml)不同作用時間(0、12、24、36、48、60、72 h)條件下對SCC15口腔癌細胞增殖活性的影響。比色法檢測Caspase-3活性的變化，通過流式細胞儀檢測細胞周期的變化。結果BAI在體外對SCC15細胞株具有直接抑制增殖作用，并呈時間和劑量依賴性，對SCC15細胞的IC50是153.20 μg/ml。不同濃度BAI處理細胞后，SCC15細胞被阻止于G0/G1期，抑制SCC15細胞分裂而降低其增殖能力。結論BAI可對人SCC15口腔癌細胞株的凋亡具有促進作用，并且促凋亡作用呈時間-劑量依賴性。BAI體外具有增加HeLa細胞Caspase-3活性的作用，能明顯上調SCC15細胞中Caspase-3活性，且呈時間與濃度依賴性。

關鍵詞〔〕黃芩素；SCC15細胞；增殖；Caspase-3活性；細胞周期

中圖分類號〔〕R737.33〔

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531664)

1佳木斯大學附屬第一醫院

第一作者：翟越(1965-)，女，主治醫師，主要從事口腔醫療及相關藥物研究。

黃芩素(BAI)具有多種藥理作用〔1〕。癌癥的發生、發展是多因素、多基因、多途徑相互作用的結果，其中細胞的增殖和凋亡的動態平衡失調是引起腫瘤發生發展的重要因素〔2〕。目前對于細胞凋亡與腫瘤的關系十分受關注。有關BAI的一些制劑已在臨床應用于上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽炎、慢性阻塞性肺病、傳染性肝炎、細菌性痢疾等多種疾病的治療，并且療效顯著。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)可催化多種細胞內特異蛋白的激活〔3〕。裂解相應的胞質胞核底物，最終導致細胞凋亡〔4〕。它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮著重要功能〔5〕。Caspase-3可經細胞色素C、Caspase-9途徑激活，也可通過另外的途徑激活。最終導致細胞凋亡，但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，Caspase-3活性明顯下降〔5〕。

1材料與方法

1.1材料及儀器SCC15口腔鱗狀癌細胞株(中科院上海細胞庫)，胎牛血清，DMEM培養基，BAI單體(純度≥9 8%，南京澤朗醫藥科技有限公司)，噻唑藍(MTT，南京建成生物工程研究所)，二辛可酸(BCA)蛋白測定試劑盒(Sigma)，Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，Galaxy CO2培養箱MiniGalaxy A型(英國RS Biotech公司)，MK3酶標儀(中國上海雷勃公司)。

1.2實驗分組DMEM培養基中添加10%胎牛血清培養SCC15細胞，將SCC15細胞按5×104/孔的密度接種于96孔細胞培養板，空白對照組培養正常細胞不添加處理因素，BAI組分別給予終濃度為50、100、200 μg/ml的BAI進行處理。

1.3MTT方法檢測細胞增殖作用將狀態良好，生長至對數生長期的細胞棄去培養液，加0.25%胰酶消化數分鐘，收集細胞于2 ml離心管中，700 r/min，離心5 min，棄上清，加入新鮮培養液，用臺盼藍進行細胞計數，根據計數的細胞數目，將SCC15細胞以5×104/孔接種于96孔培養板中，培養12 h，使細胞完全貼壁，加入不同濃度的黃芩素 (終濃度為)，每個濃度設4個平行復孔，陰性對照組加入等體積DMEM完全培養液，設空白調零孔，于37℃，5%CO2培養箱中繼續培養12、24、36、48、72 h，棄去上清，用DMEM洗3次，洗去藥物，每孔加入MTT 20 μl，繼續培養4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，10 min后于酶標儀492 nm處測OD值，計算藥物的體外生長抑制率，用細胞生長抑制率對藥物作用時間繪制回歸曲線，求出半數抑制濃度(IC50)。細胞生長抑制率(%)=(對照組平均OD值-用藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

1.4MTT檢測Caspase-3活性的變化取對數生長期細胞(5×105/ml)，對照組不添加藥物，試驗組加入不同濃度BAI(終濃度為50、100、200 μg/ml)，繼續培養12、24、48和72 h后，收集細胞，2 000 r/min離心5 min，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，棄上清；在收集的沉淀細胞中加入50 μl冰上預冷的Lysis Buffer；置冰上裂解20 min，蝸旋振蕩至澄清，4℃，10 000 r/min，離心1 min；把離心上清液轉移至新的管中，并放置冰上；測定蛋白濃度；吸取50 μl含50～200 μg蛋白的細胞裂解上清，如體積不足50 μl用Lysis Buffer補足至總體積50 μl；加入50 μl的2×Reaction Buffer；加入5 μl Caspase-3 Substrate，37℃避光孵育4 h；用酶標儀，在405 nm處測定其吸光值。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期的變化取對照組、BAI(終濃度200 μg/ml)處理48 h后的SCC15細胞單細胞懸液(1×106/ml)1 ml，SCC15細胞上清倒入標記試管中，培養瓶中加入0.25%胰酶消化，消化的SCC15細胞加入對應的試管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清。0.01 mol/L pH 7.2，PBS洗2次，1 500 r/min離心5 min。將70%乙醇緩慢滴入試管中，邊滴邊搖動試管，使SCC15細胞分散、固定，置4℃備用。將上述固定的SCC15細胞離心去上清，用0.01 mol/L pH7.2 PBS洗2次，1 500 r/min離心5 min。取200 μl單細胞樣品(1×106/ml)，加200 μl RNase溶液(10 μg/ml)，37℃水浴搖床30 min。將細胞過濾，去除聚積成團細胞，加入膜聯蛋白熒光素(Annexin V-FITC)液5 μl和碘化丙啶(PI)液10 μl，混勻，室溫避光染色15 min。PBS洗2次，去除多余染料，流式細胞儀檢測(激發波長488 nm)。

2結果

2.1BAI對SCC15口腔癌細胞株生長抑制作用BAI在體外對SCC15細胞株具有直接的抑制增殖作用，并且呈時間和劑量依賴性。利用回歸曲線，BAI對SCC15細胞的IC50是153.20 μg/ml。見表1，圖1。

2.2BAI對Caspase-3活性的影響50 μg/ml劑量的AAD作用12 h，Caspase-3活性并不明顯上升，作用24 h后，Caspase-3活性才開始增加；作用72 h，Caspase-3活性明顯增加；100和200 μg/ml AAD作用12 h，Caspase-3即開始增加，24 h時，與對照組比較顯著增加(P<0.01)，至72 h Caspase-3顯著增加；而125 μg/ml的BAI作用24 h，Caspase-3活性即增加明顯，隨著濃度和作用時間的增加，Caspase-3顯著增加，呈時間與濃度依賴性。見表2。

2.3BAI對細胞周期的影響BAI(終濃度200 μg/ml)誘導SCC15細胞48 h后，處于G0/G1期的SCC15細胞數由對照組的59.26%增加到67.36%和64.26%，而處于S期的細胞數，由對照組的25.88%減少到20.57%和21.67%，說明SCC15細胞被阻止于G0/G1期，而處于S期和G2/M期的細胞百分數都減少，而未經BAI作用的SCC15細胞增殖正常，提示BAI通過抑制SCC15細胞分裂而降低其增殖能力。

組別OD值抑制率(%)對照組0.84±0.01-50(μg/ml)0.69±0.021)17.19100(μg/ml)0.54±0.032)40.56200(μg/ml)0.42±0.012)50.73

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

圖1　黃芩素對SCC15細胞生長抑制作用

組別12h24h48h72h對照組0.08±0.010.10±0.020.13±0.020.20±0.0150(μg/ml)0.09±0.020.13±0.010.19±0.030.29±0.02100(μg/ml)0.16±0.010.24±0.021)0.42±0.031)0.69±0.021)200(μg/ml)0.24±0.031)0.40±0.041)0.52±0.051)0.90±0.091)

與對照組比較:1)P<0.01

3討論

口腔癌是頜面部常見的黏膜上皮腫瘤，多發于40～60歲人群，以舌、頰、牙齦以及腭等為好發病部位，以鱗狀細胞癌為主要病理類型，約80%〔6〕。早期的口腔癌主要為局部淋巴結轉移，到達晚期時會逐漸發生遠處轉移〔7〕。該病惡性度較高，目前仍無有效治療手段，治療仍以早發現、早診斷、早治療等措施為主。本研究也發現，BAI對SCC15口腔鱗狀細胞癌的活力的抑制作用十分顯著，且BAI濃度越高，對SCC15細胞的抑制作用越明顯，并呈劑量依賴性。本試驗通過對SCC15細胞Caspase-3活性的分析表明，BAI體外具有增加SCC15細胞Caspase-3活性的作用。BAI能明顯上調SCC15細胞Caspase-3活性，并且這種作用呈時間與濃度依賴性，本文為BAI在口腔鱗狀細胞癌治療中作用的研究提供新的思路。

4參考文獻

1Miura K，Fuiibchi W，Ishida K，etal.Inhibitor of apoptosis protein family as diagnostic markers and therapeutic targets of colorectal cancer〔J〕.Surg Today，2011;41(2):175-82.

2Oh BY，Lee RA，Kim KH.SiRNA targeting livin decreases tumor in a xenograft model for colon cancer〔J〕.World J Gastroenterol，2011；17(20):2563-71.

3Shen SC，Chen YC，Hsu FL，etal.Differential apoptosis-inducing effect of quercetin and its glycosides in human promyeloleukemic HL-60 cells by alternative activation of the caspase-3 cascade〔J〕.Cell Biochem，2003；89(5):1044-55.

4Way TD，Kao MC，Lina JK.Degradation of HER2/neu by apigenin induces apoptosis through cytochrome c release and caspase-3 activation in HER2/neu-overexpressing breast cancer cells〔J〕.FEBS Lett，2005；579(1):145-52.

5Woo DH，Han IS，Jung G.Mefenamic acid-induced apoptosis in human liver cancer cell lines through Caspase-3 pathway〔J〕.Life Sci，2004；75(20):2439-49.

6任宏宴，李善昌，唐大永.Livin、Bcl-2 在舌癌中的表達及臨床意義〔J〕.口腔頜面部外科雜志，2010;20(5):334-7.

7Khan Z，Bisen PS.Oncoapoptotic signaling and deregulated target genes in cancer:special reference to oral cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013；1836(1):123-45.

〔2013-11-07修回〕

(編輯袁左鳴)