江蘇地區H3亞型禽流感的流行病學調查分析

俞新鵬

（沛縣農業農村局，江蘇沛縣 221600）

禽流感是由正黏病毒科A 型流感病毒屬的禽流感病毒引起的禽類A 類傳染病。該病廣泛流行于世界上多個國家和地區，給養禽業和人類帶來巨大的威脅和經濟損失。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是單股負鏈、分節段的RNA 病毒，其基因組全長13 kb，含有基因片段8 個，分別編碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1 和PB2 蛋白［1］，其中血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）是比較重要的兩個基因節段。根據表面蛋白HA 和NA 的抗原性，可將AIV 分為18 個HA 亞型和11個NA亞型。目前我國常見的AIV主要有H9、H7、H5、H3、H10、H6 亞型等。目前，只有H5 和H7 的部分毒株是高致病性禽流感病毒，其他亞型都是低致病性禽流感病毒。H3 亞型禽流感病毒雖然致病性低，但其感染性和毒力不斷增強，危害趨于嚴重，特別是發生繼發感染或混合感染時，危害更大。研究表明，H3 亞型禽流感能跨越種間屏障，感染豬、馬、犬、貓等多種哺乳動物，具有很強的宿主適應性［2］。近年來，我國在不同地區和宿主中多次分離到H3亞型禽流感病毒［3］。在全球大多數國家，H3 亞型流感病毒在人流感流行病學監測中顯示為優勢毒株［4］。因此，有必要加強H3 亞型禽流感的流行病學調查，以對該病進行有效的防控，保障畜禽養殖業安全和人類健康。近期市場反饋，江蘇省部分地區蛋雞養殖場存在雞群禽流感發病與死亡情況，因此，于2023 年2 月對江蘇地區兩個疑似發生該病的蛋雞養殖場開展H3 亞型禽流感的流行病學調查，為掌握江蘇地區H3 亞型禽流感的發生及流行情況提供參考。

1 材料與方法

1.1 調查點選擇

從江蘇省鹽城市和南通市各選擇一個發病典型的蛋雞養殖場作為調查點。其中，鹽城市養殖品種為海蘭褐蛋雞，存欄量12 000只，蛋雞在52 日齡開始發病，表現為眼睛流淚、鼻孔潮濕、個別雞精神不佳、張口呼吸，夜間聽雞有呼吸道癥狀，每日死亡35只左右，日死亡率0.3%。南通養殖品種為羅曼灰，存欄量15 000 只，蛋雞在115 日齡開始發病，大群較正常，個別雞眼睛拉長，精神不佳，咳嗽，夜間聽雞有呼吸道癥狀，每日死亡30只左右，日死亡率0.2%。對當日死亡的病雞進行解剖發現，剖檢病變主要有氣管輕微出血或有黏液，支氣管干酪樣物堵塞，肺臟淤血、水腫，心冠脂肪出血點等，初步判斷為疑似禽流感。

1.2 試驗器具

禽流感病毒H5、H7、H9、H3 血凝抑制試驗抗原，生理鹽水，5 mL 注射器，100 μL 單道移液器，100 μL 8 道移液器，一次性移液器槍頭，直徑9 cm 玻璃平皿，一次性96 孔V 型板，微量振蕩器，離心機，10 mL離心管等。

1.3 試驗方法

1.3.1 血清樣品制備 在所調查的兩個蛋雞養殖場分別隨機采集30份正常雞群的血液樣品。使用一次性注射器從雞翅根靜脈采血，每只雞2 mL，將血液樣品在室溫或37 ℃恒溫箱中傾斜靜置2 h 至收集血清，標記編號，待檢。

1.3.2 血凝試驗

1）采血。使用5 mL注射器抽取1 mL濃度為3.8%的檸檬酸鈉抗凝劑，進行翅根靜脈采血。

2）紅細胞洗滌。將采集的抗凝血注射到10 mL 離心管，注入生理鹽水混勻，放入離心機內配平，3 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，重復清洗3 次，所得紅細胞沉淀加入生理鹽水，放置冰箱內4 ℃冷藏備用。

3）1%紅細胞懸液的配制。抽出所需生理鹽水，棄去紅細胞所占的量，即紅細胞與生理鹽水比例為1∶100，插入紅細胞底部抽取紅細胞，與生理鹽水混勻，反復吹吸混勻備用。

4）抗原的倍比稀釋。在96 孔V 型板標記抗原檢測項目：禽流感H5、H7、H9、H3。在其第1—11 孔均加入25 μL 生理鹽水，第12孔加入50 μL 生理鹽水；對應吸取25 μL 抗原依次加入反應板第1列，之后用100 μL 8道移液器調至25 μL依次進行倍比稀釋，即第1列反復吹吸8 次混勻后吸取25 μL 加入第2 列，抽出25 μL 混合樣品加入第2 列中，依次稀釋至第11 列，從第11 列中吸出25 μL 混合液并棄去，即完成倍比稀釋。最后用振蕩器振蕩20 s充分混勻，在室溫25 ℃靜置20 min。

5）血凝情況分析。每孔均加入配制好的1%紅細胞懸液25 μL，振蕩混勻，在25 ℃恒溫培養箱中靜置25 min。將反應板傾斜45°，觀察紅細胞懸液有無呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）孔對應的抗原最高稀釋倍數代表1個血凝單位（HAU）。

表1 蛋雞血清樣本的H5、H7、H9、H3抗體滴度

1.3.3 血凝抑制試驗

1）采血及紅細胞懸液的配置。方法同1.3.2。

2）4 單位抗原的配制與校正。根據抗原稀釋倍數=血凝效價/4，前列按1∶4稀釋的孔不加抗原，即1塊96孔V型板使用4單位抗原2 mL。校正結果判定，從左到右，96 孔V 型板前3 孔為完全血凝，第4、5、6 孔完全沉淀，說明該4單位校正結果成立。

3）待檢血清的倍比稀釋。將被檢血清進行標號，每8 個樣品為1 套，在96 孔V 型板上標明場區和檢測項目：禽流感H5、H7、H9、H3。第1—11列的孔中加入25 μL生理鹽水，每個板第12 列作為陰性對照，加入生理鹽水50 μL。將待檢血清對應加入每個板的第1列，每孔均加入25 μL，之后按照對抗原的倍比稀釋方法完成倍比稀釋。

4）抗原加入。向稀釋好的血清中加入配制的4單位抗原，每孔加入25 μL，最后一列作為陰性對照，不加，之后用振蕩器振蕩20 s 充分混勻，在室溫25 ℃靜置20 min。

5）血凝抑制情況分析。在96 孔V 型板中每孔加入25 μL 的1%紅細胞懸液，振蕩20 s 充分混勻，在25 ℃恒溫培養箱中靜置25 min。之后將96 孔V 型板傾斜45°，2 min內進行觀察，紅細胞懸液凝集孔對應的血清最高稀釋倍數為該血清的HI 抗體效價，即抗體滴度；半流的孔不作為分析結果。

2 結果與分析

由表1可知，鹽城采樣點蛋雞血清樣本的H5、H7、H9 平均抗體滴度分別為6.9、7.0、7.2；南通采樣點蛋雞血清樣本的H5、H7、H9平均抗體滴度分別為9.2、9.2、9.0。二者蛋雞血清樣本的H5、H7、H9 抗體水平均較正常。而在未進行疫苗免疫的情況下，兩個采樣點蛋雞血清樣本的H3 平均抗體滴度分別為4.5、4.3，且變異系數（CV）較大，分別為39.9%、46.8%。結合對病死雞的臨床觀察及解剖結果表明，蛋雞群可能存在H3 亞型禽流感病毒感染。

3 討論

近年來，H3 亞型禽流感病毒分離率較高，致病力有增強的趨勢，危害持久，能長期存在于家禽體內［5-7］。前人研究發現，AIV 與人的H3 流感病毒關系密切［8-9］。另外，H3 亞型禽流感病毒還能與H9N2、H5N1 亞型流感病毒發生基因重組，人源和禽源流感病毒還能通過豬發生基因重排［10］，導致AIV 致病性增強，給禽流感防控帶來更大困難。因此，對家禽AIV 進行長期的流行病學監測，密切關注AIV 傳播、進化和變異情況，為進一步強化防控H3 亞型禽流感病毒跨種屬傳播提供充足的數據基礎，具有重要的公共衛生學意義。

世界上有8條候鳥遷徙路線，經過我國的主要有3 條路線，分別是西部候鳥遷徙線、中部候鳥遷徙線、東部候鳥遷徙線。此外，野鳥作為禽流感病毒的天然宿主，為流感病毒的變異提供了有利條件。2005 年，我國學者在青海湖分離到的高致病性禽流感病毒，經證實其是由候鳥帶入我國［5］。另有研究從廣東地區健康鴨體內分離到H3N6 病毒E9 株，懷疑其HA 和NA 基因可能由候鳥遷徙經境外帶入我國，且可能是由國外的H3亞型AIV 與H4N6亞型AIV重組而來［6］。2023年2月，江蘇省鹽城市和南通市兩地蛋雞場雞群在育成期和開產前出現眼睛流淚、鼻孔潮濕、個別雞精神不佳、張口呼吸、咳嗽等癥狀，日死亡率為0.2%～0.3%，對其開展禽流感流行病學調查，經臨床癥狀觀察并剖檢病變，以及血凝抑制抗體檢測等判斷，屬于H3 亞型低致病性禽流感病毒導致發病。原因可能與東部遷徙路線中的候鳥或與當地野鳥攜帶病毒等有關。因此，應做好相應的疾病監測與預警，開展綜合防控。

4 結論

江蘇省鹽城市和南通市兩個發病蛋雞養殖場正常雞群的血清學抗體檢測結果顯示，該兩個蛋雞養殖場正常雞群H5、H7、H9 亞型禽流感病毒的平均抗體水平較正常，鹽城市正常雞群的抗體滴度平均值分別為6.9、7.0、7.2，南通市正常雞群的抗體滴度平均值分別為9.2、9.2、9.0。在無疫苗免疫情況下，兩個蛋雞場正常雞群的H3 平均抗體滴度分別為4.5、4.3，且變異系數較大，分別為39.9%、46.8%。結合對發病雞的臨床觀察及解剖結果表明兩個蛋雞場可能存在H3 亞型禽流感野毒的感染。