針刺人迎穴調控RhoA/ROCK1 通路改善自發性高血壓大鼠血壓及血管損傷的機制研究*

周詩遠，楊永可，熊飛然，陸妍，趙軼文，劉嘉妍，史慧妍，石學敏

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院針灸科，天津 300193；2.國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；3.寧波市北侖區人民醫院康復科，寧波 315800；4.河北省三河市中醫院中醫科，廊坊 065200；5.天津市北辰區雙環邨街社區衛生服務中心中醫科，天津 300134；6.天津中醫藥大學，天津 300193；7.天津市西青區中北鎮社區衛生服務中心針灸科，天津 300111）

高血壓病是最常見的慢性病，常被稱為“無聲的殺手”，大多數臨床患者可在沒有任何癥狀的情況下發病，并且血管壁長期承受著高于正常的壓力會導致冠心病、腦卒中等嚴重的心腦血管疾病。心腦血管疾病現已成為中國人口死亡的主要原因，高血壓病正是其首要的危險因素[1]。流行病學調查研究顯示，2015 年中國18 歲以上人群中已有2.45 億的高血壓病患者[2]，2017 年中國有254 萬人死于收縮壓升高，傷殘調整壽命年超過5%[3]。高血壓病的病理過程為復雜的血管生物學改變，主要以血管重構為突出表現，這也是高血壓導致靶器官損傷的結構基礎。目前高血壓病的治療目標不再僅僅是以血壓降低為標準，更重要的是對靶器官的保護，以降低致殘率和病死率[4]。

“活血散風” 針刺法是石學敏院士針對高血壓病的治療而創立，此法以人迎穴為主穴，具有明確手法量學標準，是治療高血壓病的一套規范、成熟的方法[5]。石院士認為由氣海失司導致氣逆而上引發的高血壓直接輸出于人迎穴，因此針刺此處能直接調節氣海，使上逆之氣歸于平和，起到穩定血壓的作用。但對其機制尚不清楚。高血壓導致的靶器官損害其早期常表現為頸動脈內中膜的增厚，研究表明RhoA/ROCK 信號通路與高血壓以及血管損傷的發病機制密切相關[6]。前期諸多臨床研究證實針刺人迎穴在降低血壓及改善血管損傷發揮靶器官保護方面顯示出了一定的優勢[7-8]，因此推測針刺人迎穴可能通過調控RhoA/ROCK 信號通路介導的血管損傷發揮降壓及靶器官保護的作用。本實驗采用自發性高血壓大鼠模型，通過觀察針刺人迎穴對大鼠平均動脈壓及血管損傷相關調控因子內皮素-1（ET-1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、人血小板衍化生長因子-AA（PDGF-AA）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）和RhoA、ROCK1 表達的影響，揭示人迎穴降壓及改善血管損傷的作用機制，從而為針刺降壓及針刺保護靶器官提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF 級11 周齡雄性自發性高血壓大鼠27 只，體質量（350±50）g，隨機分為模型組（SHR）、西藥組（Medicine）、針刺組（Acup），每組各9 只，同周齡雄性Wistar 大鼠9 只，體質量（300±50）g作為正常組（Wistar）。以上動物均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK （京）2016-0006，每5 只一籠飼養，適應性飼養1 周后進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 中研太和牌一次性無菌針灸針（0.25 mm×40 mm）；鼠尾無創血壓儀（北京軟隆生物技術有限公司BP98A）；PCR 擴增儀（德國，Eppendorf公司）；熒光定量PCR 儀Rotor Gene 6000（美國，Corbett 公司）；BioPhotometer plus（德國，Eppendorf公司）；多功能酶標儀（美國Thermo 公司，Varioskan LUX）；伯樂基礎電泳儀（美國，BIORAD 公司）；伯樂垂直電泳槽（美國，BIORAD 公司）；伯樂轉移電泳槽（美國，BIORAD 公司）；Chemstudio 多功能成像儀（德國耶拿，G119717）。

1.2.2 主要試劑 大鼠ANG-Ⅱ酶聯免疫吸附實驗（ELISA）Kit武漢華美生物CSB-E04494r；大鼠ROCK1 ELISA Kit 武漢華美生物CSB-el020058ra；Anti- ET-1 antibody [TR.ET.48.5] ab2786；Anti- PDGF-AA antibody[EPR19924] ab203911；Anti-MMP2 antibody ab37150；Anti-Rho antibody[EP487Y] ab40673；Alexa Fluor 594標記山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG，H+L）中杉金橋ZF-0513；Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔IgG（H+L）中杉金橋ZF -0516；BCA protein assaykit CWBIO CW0014S；Trizol Reagent（Invitrogen life technologies公司，15596-018）；Oligo（dT）18 primer（Thermo 公司，MAN0013109）；HiFi-MMLV 逆轉錄酶（CWBIO 公司，CW0744M）；高純dNTP（10 mmol/L，each，CWBIO公司）。

1.3 治療及檢測方法

1.3.1 穴位選取 人迎穴：參照中國針灸學會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”[9]，根據人和大鼠解剖特點和人迎穴定位特點，確定大鼠人迎穴定位：頸部三角區內，當胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌上緣交點，約當頸總動脈分叉處，體表可觸及搏動。

1.3.2 治療方法 人迎組：直刺5 mm，可見針柄隨頸動脈搏動而上下振動。西藥組：厄貝沙坦[安博維，30 mg/（kg·d）]，溶解于2 mL 水中，灌胃。SHR 組和Wistar 組不治療但給予相同的抓取。針刺采用管針垂直進針約5 mm，以保證刺入深度的一致性。針刺入穴位后行捻轉補法30 s（向前用力為補），然后留針1 min。治療為5 次/周，連續6 周。

1.3.3 血壓測量 將大鼠裝入測血壓固定器中，待大鼠平靜波形穩定后，給尾套充氣加壓測量大鼠血壓，測量3 次取平均值作為大鼠本次血壓值。各組大鼠共針刺6 周，并于干預前，治療3 周，治療6 周測量3 次平均動脈血壓值。

1.4 取材及檢測指標和方法

1.4.1 取材 用10%水合氯醛對大鼠進行麻醉后取頸動脈組織，組織經磷酸鹽緩沖溶液（PBS）及4%多聚甲醛灌注取材后保存于多聚甲醛溶液的標本瓶或凍存管中，放于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.4.2 ELISA 測定AngⅡ、ROCK1 的濃度 取頸動脈組織100 mg 加入1 mL PBS 進行勻漿，3 000 r/min，離心15 min，離心半徑8 cm，離心后取上清液進行檢測；或取血液離心取血清進行檢測。依照試劑盒說明書加樣、孵育、顯色，用酶標儀測定每孔OD 值（吸光度設為450 nm 波長）；用公式計算頸動脈組織AngⅡ和血清中ROCK1 的濃度。

1.4.3 實時熒光定量PCR 法檢測ET-1 和PDGFAA 基因表達 取頸動脈組織100 mg 剪碎液氮研磨，加入Trizol 裂解液提取總RNA，將mRNA 反轉cDNA 后，將體系進行擴增，反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共33 個循環，總反應體系20 μL。擴增PCR引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測ET-1 和PDGF-AA 蛋白表達 取頸動脈組織100 mg 剪碎加入裂解液裂解30 min，離心后取上清液，BCA 法計算樣本蛋白濃度。加入蛋白緩沖液，在100 度沸水浴中反應10 min 使蛋白變性，制備分離膠和濃縮膠上樣后進行電泳，采用半干轉法進行轉膜、封閉、洗膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜；室溫平衡30 min 后洗膜，加入二抗，37 ℃孵育1 h 后，進行ECL 反應成像出圖，用Image J 軟件對條帶灰度值進行分析。

1.4.5 免疫熒光檢測MMP2、RhoA 蛋白定位及表達取頸動脈組織于4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切成4 μm 的組織切片，將石蠟切片脫蠟至水，滴加一抗工作液（1%BSA 稀釋）：MMP2 1∶150 或RhoA 1∶100 4 ℃過夜；結合二抗工作液Alexa Fluor 594 標記山羊抗鼠IgG 滴度為1∶80 或Alexa Fluor 594 標記山羊抗兔IgG 滴度為1∶80，洗滌后封片，在顯微鏡下觀察并拍片。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，進一步進行組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD 法；若方差不齊采用Games-Howell 法；多時點采用重復測量方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別大鼠平均動脈壓結果 與正常組比較，模型組、西藥組、針刺組在治療前，治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓均顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，西藥組和針刺組在治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓顯著降低（P＜0.05），與西藥組比較，針刺組在治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓差異無統計學意義（P＞0.05），與治療前比較，西藥組和針刺組在治療3 周，治療6 周時的平均動脈壓顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組別平均動脈壓結果比較（±s）Tab.2 Comparison of mean arterial pressure results among different groups（±s） mmHg

表2 不同組別平均動脈壓結果比較（±s）Tab.2 Comparison of mean arterial pressure results among different groups（±s） mmHg

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與本組治療前比較，△P＜0. 05；1 mmHg≈0.133 kPa。

組別 動物數 治療前 治療3 周 治療6 周正常組 9 126.54±25.20 111.25± 9.07 121.46± 4.69模型組 9 164.33±14.65* 172.18±19.04* 165.33±23.37*西藥組 9 176.00±16.90* 157.03±16.85*#△ 143.15±10.51*#△針刺組 9 169.20±14.63* 157.17± 8.73*#△ 152.10± 7.79*#△

2.2 不同組別大鼠頸動脈組織中ET-1 和PDGFAA mRNA 表達結果 與正常組比較，模型組在治療6 周時的ET-1 和PDGF-AA 的mRNA 表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和針刺組在治療6 周時ET-1 和PDGF-AA 的mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）。見表3。

表3 頸動脈組織內ET-1，PDGF-AA mRNA 的水平（±s）Tab.3 Levels of ET-1 and PDGF-AA mRNA in carotid artery tissue（±s）

表3 頸動脈組織內ET-1，PDGF-AA mRNA 的水平（±s）Tab.3 Levels of ET-1 and PDGF-AA mRNA in carotid artery tissue（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 ET-1（2-ΔΔCt） PDGF-AA（2-ΔΔCt）正常組 3 1.00±0.24 1.00±0.34模型組 3 1.59±0.22* 1.78±0.48*西藥組 3 1.08±0.38# 1.05±0.25#針刺組 3 1.10±0.06# 1.04±0.26#

2.3 不同組別大鼠頸動脈組織ET-1 和PDGF-AA蛋白表達結果 與正常組比較，模型組在治療6 周時的ET-1 和PDGF-AA 的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和針刺組在治療6 周時ET-1 和PDGF-AA 的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。見圖1，表4。

圖1 干預后各組大鼠PDGF-AA，ET-1 的蛋白表達Fig.1 Protein expression of PDGF-AA and ET-1 in each group of rats after intervention

表4 頸動脈組織內ET-1 ，PDGF-AA 的蛋白表達水平（±s）Tab.4 The protein expression levels of ET-1 and PDGF-AA in carotid artery tissue（±s）

表4 頸動脈組織內ET-1 ，PDGF-AA 的蛋白表達水平（±s）Tab.4 The protein expression levels of ET-1 and PDGF-AA in carotid artery tissue（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 ET-1/β-actin PDGF-AA/β-actin正常組 3 0.24±0.03 0.30±0.03模型組 3 0.69±0.12* 0.66±0.22*西藥組 3 0.47±0.03# 0.41±0.08#針刺組 3 0.49±0.09# 0.37±0.11#

2.4 不同組別大鼠頸動脈組織MMP2 和RhoA 免疫熒光結果 與正常組比較，模型組、西藥組和針刺組在治療6 周時的MMP2 和RhoA 的蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組在治療6 周時RhoA 的蛋白表達顯著降低（P＜0.05），針刺組在治療6 周時MMP2 和RhoA 的蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。見表5，免疫熒光染色圖見OSID 二維碼。

表5 頸動脈組織內MMP2，RhoA 的水平（±s）Tab.5 The levels of MMP2 and RhoA in carotid artery tissue（±s）

表5 頸動脈組織內MMP2，RhoA 的水平（±s）Tab.5 The levels of MMP2 and RhoA in carotid artery tissue（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數 MMP2 RHOA正常組 5 4.68±0.93 4.76±0.75模型組 5 53.12±5.04* 53.72±3.23*西藥組 5 48.64±9.49* 46.08±7.59*#針刺組 5 43.68±7.11*# 44.40±7.67*#

2.5 不同組別大鼠頸動脈組織Ang Ⅱ和血清ROCK1 ELISA 結果 與正常組比較，模型組，西藥組和針刺組在治療6 周時的AngⅡ和ROCK1 的蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組和針刺組在治療6 周時AngⅡ和ROCK1 的蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，針刺組在治療6 周時AngⅡ和ROCK1 的蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。見表6。

表6 頸動脈組織AngⅡ和血清ROCK1 的水平（±s）Tab.6 The levels of Ang Ⅱin carotid artery tissue and serum ROCK1（±s）

表6 頸動脈組織AngⅡ和血清ROCK1 的水平（±s）Tab.6 The levels of Ang Ⅱin carotid artery tissue and serum ROCK1（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 AngⅡ（pg/mg） ROCK1（ng/mL）正常組 3 182.25±8.09 5.93±0.09模型組 3 257.56±6.32* 37.34±2.42*西藥組 3 229.50±0.82*# 24.24±0.35*#針刺組 3 205.69±0.75*#△ 18.10±0.25*#△

3 討論

高血壓病的發生發展與血管結構和功能的異常有著密切的關系，高血壓通過各種因素引發血管損傷，同時血壓的升高也加劇了血管損傷最終造成心，腦，腎等靶器官損害，壓力水平與血管損傷之間是一個逐漸加劇的過程，兩者相互關聯，并相互促進[10-11]。高血壓病造成的血管損傷是一個復雜的病變過程，涉及到血管的內膜、中膜、外膜及細胞外基質的參與。內皮素-1（ET-1）是由血管內皮細胞合成的一種縮血管多肽，血管內皮細胞損傷后釋放活性物質破壞自身調節體系平衡，導致ET-1 合成增多，血管張力調節功能紊亂，內皮依賴性舒張力下降，血管壁結構發生改變，繼而導致血壓升高[12-13]。有研究表明腎素血管緊張素醛固酮系統（RAAS）與高血壓有著密切的關系，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAAS中最重要的效應分子之一，是一種縮血管因子，可促進外周血管收縮和醛固酮分泌導致血壓升高[14-15]。血小板源生長因子（PDGF）是血小板、內皮細胞、平滑肌細胞肌細胞和滋養層細胞等細胞產生的一類細胞因子，PDGF 有3 個二聚體（AA、BB、AB），PDGFAA 是其亞型之一。研究顯示[16-18]，PDGF-AA 能促進多種細胞的增殖和分裂，PDGF-AA 正常分泌能誘導血管的生成，異常升高能夠引起血管的強烈收縮及粥樣硬化性病變[19]。另有研究發現，血管內膜損傷后，它周圍的內皮細胞會釋放出一些促生長因子，如PDGF 和ET-1 等，啟動平滑肌細胞增殖引發血管重構[20]。基質金屬蛋白酶2（MMP2）是一種鋅依賴性酶，能切割細胞外基質成分，研究表明MMP2 在多種因素所致血管損傷過程中均發揮重要作用，其在內皮細胞、平滑肌細胞、纖維細胞和巨噬細胞等多種不同類型的細胞中都可分泌，MMP2 作為血管重構調節的重要信號通路之一，其激活可引發細胞炎癥反應、氧化應激反應，造成血管損傷[21-22]。本實驗結果顯示，針刺人迎穴能明顯降低SHR 大鼠的平均動脈壓，且能達到與西藥相似的降壓療效，并隨著針刺時間的增加，治療6 周比3 周能達到更好的降壓效果。表明針刺發揮效應的方式是隨時間而蓄積的，與藥物相比，針刺發揮作用的方式相對較緩，這樣可避免血壓大幅度波動對血管造成的損傷。同時針刺人迎穴后頸動脈組織中ET-1、PDGF-AA、AngⅡ、MMP2 的表達水平明顯下降。表明針刺可能通過調節血管釋放出的相關活性因子來改善血壓并抑制血管損傷。

Rho 蛋白是小G 結合蛋白Ras 超家族成員之一，其通過激活下游蛋白激酶ROCK 而產生多種生物學效應，如介導內皮功能異常、血管平滑肌的收縮、肌動蛋白細胞骨架形成、細胞黏附與遷移、細胞增殖與凋亡等，因此RhoA/ROCK 通路在如高血壓病、動脈粥樣硬化、心力衰竭等心血管疾病的病理過程中發揮了重要作用是治療的新靶點[23-24]。研究表明ET-1 作為內皮細胞分泌的一種強烈的可收縮血管的活性物質，是調控RhoA/ROCK 通路重要的因子，并可通過RhoA/ROCK 通路影響血管的收縮和內皮的功能[25]。AngⅡ作為RAAS 系統的主要生物活性肽通過G 蛋白偶聯受體AT1 受體刺激血管平滑肌細胞的肥大、增殖和遷移，有研究表明AT1 受體的激活可引起HEK293 和A10 細胞形態的改變，這種改變是依賴RhoA/ROCK 通路所介導[26-27]。PDGF 作為重要的生長因子，可促進血管平滑肌細胞的有絲分裂和趨化效應，參與血管損傷重構過程中新生內膜的形成，并能通過Rho/ROCK 通路影響血管平滑肌細胞的增殖與遷移[28]。血管平滑肌細胞從中膜向內膜遷移需要克服許多屏障，主要是其周圍的細胞外基質，MMPs 是降解細胞外基質的主要酶類，在血管平滑肌細胞的遷移過程中發揮了重要作用。有研究利用siRNA 干擾技術使血管平滑肌細胞中ROCK1的表達下調，結果顯示在ROCK1 表達下調的同時MMP2 的表達和活性也隨之降低，表明MMP2 可能是ROCK1 的下游分子并影響血管平滑肌細胞的遷移[29-30]。本實驗結果顯示，針刺人迎穴在調節ET-1、PDGF -AA、Ang Ⅱ、MMP2 因子同時能明顯降低RhoA、ROCK1 表達水平。表明針刺可能通RhoA/ROCK1 通路來改善血壓并抑制血管損傷。

綜上所述，針刺人迎穴不僅可以降低血壓，還可抑制血管損傷進而保護靶器官，其機制可能與調節血管釋放出的相關活性因子有關，且可能通過調控RhoA/ROCK1 信號通路發揮作用。本研究從基礎實驗方面為針刺降壓及靶器官的保護提供了實驗證據，為高血壓病的治療提供了新的手段，可提前預防和控制由高血壓病引發的血管損傷進而導致靶器官損害而引發的一系列心腦血管疾病。