通竅活血湯調節Nrf2 通路對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷血管保護及神經功能改善作用研究*

康花民，李淑紅，邊玉璽，耿靜，劉紅娟，何志紅，金穎

（石家莊市人民醫院急診科，石家莊 050000）

缺血缺氧性腦損傷是目前臨床中常見的新生兒中樞神經系統疾病，其發病機制主要為母體和胎兒間血液循環及氣體交換障礙，進而導致新生兒發生腦神經元壞死、基底神經節變性等病理改變，同時，缺血缺氧性腦損傷也是導致新生兒智力缺陷甚至終身殘障的重要原因之一[1]。然而，目前臨床中對于新生兒缺血缺氧性腦損傷的治療藥物有限且預后較差，給患兒家庭和社會帶來巨大的經濟負擔，因此對于新生兒缺血缺氧性腦損傷治療藥物的研發仍是當前工作重點。核轉錄因子2（Nrf2）通路是近年來發現的與缺血缺氧性腦損傷密切相關的重要信號通路，Nrf2 通路及相關蛋白水平的異常是導致缺血缺氧性腦損傷發生發展的關鍵因素[2]，且研究證實調節Nrf2 通路可能是治療缺血缺氧性腦損傷有效方法[3]。通竅活血湯由麝香、川芎、赤芍等多種中藥材組成，具有活血通絡，清瘀散結等多種功效。有研究認為通竅活血湯在腦損傷及神經損傷的修復中存在較大潛力[4]，因此，本實驗通過研究通竅活血湯對于新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的改善作用及機制，為通竅活血湯的藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 通竅活血湯由麝香（批號210806）0.15 g、川芎（批號210601）3 g、赤芍（批號210423）3 g，桃仁（批號210816）9 g，紅花（批號210718）9 g，生姜（批號210919）9 g，大棗（批號210521）6 g，蔥白（批號210811）6 g，黃酒（批號190819）250 mL 組成（中藥飲片購自北京同仁堂藥業有限公司），將川芎、赤芍、桃仁、紅花、生姜、大棗、蔥白置于黃酒中煎煮至150 mL，加入麝香繼續煎煮，沸騰兩次并濃縮至生藥含量為1 g/mL 的制劑； 神經節苷脂（批號2106231） 購自齊魯制藥有限公司；蘇木精-伊紅（HE）試劑盒（批號G1120）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號BC0170）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（批號BC0025）及腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA 試劑盒（批號SEKR-0009）、BCA 試劑盒（批號PC0020）、白介素（IL）-1β ELISA試劑盒（批號SEKR-0002） 及IL-6 ELISA 試劑盒（批號SEKR-0005）購自北京索萊寶科技有限公司；化學發光試劑盒（批號P0018）、組織裂解液（批號P0013）、PCR 試劑盒（批號D7260）購自碧云天生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（批號WLA088）購自沈陽萬類生物科技有限公司；GAPDH （批號ab181602）、核轉錄因子2（Nrf2，批號ab92946、血紅素氧合酶-1 （HO-1，批號ab68477）、Janus 激酶2（JAK2，批號ab108596）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3，批號ab68153）一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG，批號ab6721）購自艾博抗貿易有限公司；血清可溶性內皮細胞蛋白C受體（sEPCR）ELISA 試劑盒（批號EK-R38890）購自上海酶研生物科技有限公司；可溶性血栓調節蛋白（sTM）ELISA 試劑盒（批號YE02629）購自上海遠慕生物科技有限公司、內皮素（ET）-1 ELISA 試劑盒（批號CSB-E06979r-1） 購自上海恒斐生物科技有限公司；PCR 引物設計及合成由賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.2 實驗動物 1 周齡SD 雄性大鼠，體質量10～12 g，健康清潔級，購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（冀）2022-001，動物房溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，每12 h 明暗交替光照。

1.3 實驗儀器 DB001 型Morris 水迷宮購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司；Ⅸ83 熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯；Gel Doc EZ 凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司；himac CR22N 高速冷凍離心機購自Eppendorf 艾本德中國有限公司；RM2235 石蠟切片機購自德國Leica 公司；Spark 多功能酶標儀帝肯實驗器材有限公司。

1.4 方法

1.4.1 缺血缺氧性腦損傷大鼠模型的建立 大鼠采用隨機數字表法分為正常對照組（12 只）及造模組（63 只），造模組參照文獻[5]方法建立缺血缺氧性腦損傷大鼠模型，采用吸入乙醚法進行麻醉，麻醉后置于操作臺上分離頸總動脈，并進行結扎，縫合傷口，大鼠恢復1 h 后，置于37 ℃恒溫低氧箱中，低氧箱氣體構成為8%氧氣及92%氮氣，氣流速度為5 L/min，2 h 后取出放回飼養籠。隨機取3 只大鼠進行腦組織病理學檢查以驗證造模是否成功，如鏡下可見腦組織炎癥細胞浸潤，細胞排列不整齊，腦組織細胞通透性改變或空泡樣壞死視為腦組織炎癥損傷，每張切片炎癥損傷面積超過切片的10%視為造模成功。正常對照組僅切開皮膚后分離頸總動脈，縫合，不進行頸總動脈結扎。造模完成后大鼠隨機分為腦損傷組、通竅活血湯低劑量組、通竅活血湯中劑量組、通竅活血湯高劑量組及神經節苷脂組，每組12 只。

1.4.2 給藥 通竅活血湯低、中、高劑量組分別按照4、8、16 g/kg（以生藥含量計）[6]的劑量灌胃給予通竅活血湯，神經節苷脂組按照10 mg/kg[7]的劑量腹腔注射神經節苷脂，每日1 次，連續14 d[6]，正常對照組及腦損傷組灌胃給予生理鹽水。

1.4.3 Morris 水迷宮實驗 Morris 水迷宮中設置低于水面1 cm 的平臺，將大鼠置于Morris 水迷宮中，第1～5 d 訓練大鼠，引導大鼠到達平臺且停留10 s，第6 天撤除平臺，將平臺所在象限記為靶象限，將大鼠置于Morris 水迷宮，記錄90 s 內大鼠在靶象限停留時間及穿越平臺次數。

1.4.4 大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量的測定 按照35 mg/kg 的劑量腹腔注射給予大鼠戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，大鼠斷頭處死并取血至離心管，室溫靜置30 min，8 000 r/min，4 ℃離心（離心半徑13 cm）10 min，取血清，按照sEPCR、sTM、ET-1 ELISA 試劑盒方法測定sEPCR、sTM、ET-1 含量。

1.4.5 大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平測定 大鼠處死后取頸總動脈血管，組織研磨勻漿后，4 ℃條件下，8 000 r/min，離心（離心半徑13 cm）10 min，取上清液，按照SOD、MDA、TNF-α ELISA 試劑盒方法測定SOD、MDA 及TNF-α 水平。

1.4.6 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平測定取大鼠腦組織，按照TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA試劑盒方法測定腦組織研磨勻漿液中TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平。

1.4.7 大鼠海馬組織病理學檢查 頸椎脫臼法處死大鼠，分離海馬組織，常規HE 染色并在顯微鏡下進行病理學檢查。

1.4.8 大鼠海馬組織Nrf2、HO -1、JAK2、STAT3 mRNA 水平測定 大鼠頸椎脫臼處死并分離海馬組織，提取總RNA 后逆轉錄為cDNA，使用PCR 試劑盒檢測海馬組織GAPDH、Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA 水平，結果按照2-ΔΔct法，以GAPDH 為內參，計算各基因相對表達量。引物序列見表1。采用20 μL反應體系：qPCR Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 2 μL，蒸餾水補充至20 μL。反應程序為：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，共計40 個循環，60 ℃退火30 s。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.4.9 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 蛋白水平檢查 大鼠頸椎脫臼法處死，分離海馬組織，研磨勻漿后，4 ℃，12 000 r/min，離心（離心半徑13 cm）10 min，取上清液，BCA 法對總蛋白定量，分別經電泳分離、轉膜、封閉后，使用Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 及GAPDH 兔抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST 清洗后，山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST 再次清洗后，使用化學發光液在凝膠成像儀中成像，用ImageJ 1.8.0 軟件，檢測各蛋白灰度值，以GAPDH 為內參，計算Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3相對水平。

1.5 統計學處理 所有數據使用SPSS26.0 軟件進行處理分析，數據均符合正態分布且方差齊，數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數的影響 與正常對照組比較，腦損傷組大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數顯著減少（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數明顯增加（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數逐漸增加。見表2。

表2 大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數（±s）Tab.2 Target quadrant residence time and times of crossing the platform in rats（±s）

表2 大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數（±s）Tab.2 Target quadrant residence time and times of crossing the platform in rats（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P<0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 靶象限停留時間（s） 穿越平臺次數（次）正常對照組 53.67±1.56 9.19±0.84腦損傷組 17.11±2.09* 2.56±0.36*通竅活血湯低劑量組 29.08±1.57# 4.55±0.32#通竅活血湯中劑量組 40.45±1.41#△ 6.72±0.53#△通竅活血湯高劑量組 48.03±1.91#△▲ 8.31±0.79#△▲神經節苷脂組 51.49±1.72# 8.81±0.62#

2.2 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量的影響 與正常對照組比較，腦損傷組大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量逐漸降低。見表3。

表3 大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量（±s）Tab.3 Levels of serum sEPCR，sTM and ET-1 in rats（±s）

表3 大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 含量（±s）Tab.3 Levels of serum sEPCR，sTM and ET-1 in rats（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 sEPCR（μg/L） sTM（μg/L） ET-1（ng/mL）正常對照組 0.79±0.31 1.79±0.25 1.04±0.09腦損傷組 5.58±0.81* 7.34±0.67* 6.71±0.84*通竅活血湯低劑量組 3.80±0.28# 5.78±0.55# 4.89±0.45#通竅活血湯中劑量組 2.63±0.51#△ 3.37±0.44#△ 3.34±0.98#△通竅活血湯高劑量組 1.05±0.14#△▲ 2.09±0.51#△▲ 1.12±0.35#△▲神經節苷脂組 1.56±0.33# 2.84±0.26# 1.91±0.29#

2.3 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平的影響 與正常對照組比較，腦損傷組大鼠血管組織SOD 顯著降低（P＜0.05），MDA 及TNF-α 顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組大鼠血管組織SOD 顯著升高（P＜0.05），MDA及TNF-α 顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠血管組織SOD 逐漸升高，MDA 及TNF-α 逐漸降低。見表4。

表4 大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平（±s）Tab.4 Levels of SOD，MDA and TNF-α in vascular tissue of rats（±s）

表4 大鼠血管組織SOD、MDA 及TNF-α 水平（±s）Tab.4 Levels of SOD，MDA and TNF-α in vascular tissue of rats（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 SOD（U/mg） MDA（μmol/g）TNF-α（ng/mL）正常對照組 97.13±2.09 4.13±1.26 26.93±1.36腦損傷組 42.05±1.68* 14.72±1.11* 67.41±2.13*通竅活血湯低劑量組 61.90±1.49# 10.02±2.74# 53.04±1.99#通竅活血湯中劑量組 75.31±1.60#△ 7.35±0.96#△ 42.17±0.97#△通竅活血湯高劑量組 92.43±2.76#△▲ 4.85±1.72#△▲28.21±1.40#△▲神經節苷脂組 87.17±1.47# 5.59±1.31# 30.53±1.74#

2.4 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 的影響 與正常對照組比較，腦損傷組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組大鼠腦組織TNFα、IL-1β 及IL-6 顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 逐漸降低。見表5。

表5 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平（±s）Tab.5 Levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain of rats（±s） pg/mL

表5 大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平（±s）Tab.5 Levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in brain of rats（±s） pg/mL

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 TNF-α IL-1β IL-6正常對照組 37.23±2.71 19.57±1.26 32.78±1.46腦損傷組 169.70±3.30* 87.25±2.72* 160.11±2.29*通竅活血湯低劑量組 93.28±3.84# 57.93±1.85# 83.13±4.12#通竅活血湯中劑量組 67.19±2.88#△ 41.52±2.16#△ 67.33±2.98#△通竅活血湯高劑量組 47.31±1.92#△▲24.36±2.13#△▲39.59±2.50#△▲神經節苷脂組 53.53±1.89# 29.62±1.94# 44.05±3.31#

2.5 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織病理學影響 正常對照組海馬組織無病理性改變，與正常對照組比較，腦損傷組海馬組織炎癥損傷及細胞脫落，與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組海馬組織炎癥浸潤明顯減輕，病理性改變明顯減輕。見圖1。

圖1 大鼠海馬組織病理學檢查結果（HE，×200）Fig.1 Histopathological examination results in hippocampus tissue of rats(HE，×200)

2.6 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA 水平的影響 與正常對照組比較，腦損傷組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），JAK2、STAT3 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），JAK2、STAT3 mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 mRNA 水平逐漸升高，JAK2、STAT3 mRNA 水平逐漸降低。見表6。

表6 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA水平（±s）Tab.6 Levels of Nrf2，HO-1，JAK2 and STAT3 mRNA in hippocampus tissue of rats（±s）

表6 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 mRNA水平（±s）Tab.6 Levels of Nrf2，HO-1，JAK2 and STAT3 mRNA in hippocampus tissue of rats（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與腦損傷組比較，#P＜0.05；與通竅活血湯低劑量組比較，△P＜0.05；與通竅活血湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 Nrf2 HO-1 JAK2 STAT3正常對照組 7.17±0.29 5.69±0.42 0.53±0.09 0.48±0.15腦損傷組 0.44±0.12* 0.82±0.22* 6.87±0.86* 5.46±0.62*通竅活血湯低劑量組2.56±0.26# 2.01±0.21# 4.23±0.77# 4.41±0.38#通竅活血湯中劑量組 4.45±0.35#△ 3.86±0.17#△ 2.89±0.67#△ 2.95±0.28#△通竅活血湯高劑量組 6.89±0.32#△▲5.19±0.38#△▲0.97±0.31#△▲0.97±0.20#△▲神經節苷脂組 5.48±0.43# 4.05±0.28# 1.33±0.42# 1.34±0.41#

2.7 通竅活血湯對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 蛋白的影響 與正常對照組比較，腦損傷組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），JAK2、STAT3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與腦損傷組比較，通竅活血湯低、中、高劑量組及神經節苷脂組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），JAK2、STAT3 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），且隨著通竅活血湯劑量的增加，大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白水平逐漸升高，JAK2、STAT3 蛋白水平逐漸降低。見圖2。

圖2 大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、JAK2、STAT3 蛋白水平（±s）Fig.2 Levels of Nrf2，HO-1，JAK2 and STAT3 protein in hippocampal tissue of rats（±s）

3 討論

新生兒腦損傷是臨床中常見的中樞神經功能障礙性疾病，常見于先天性腦發育不全、腦性癱瘓及嬰兒期創傷或嚴重疾病所遺留的并發癥，其中缺血缺氧性腦損傷是臨床中常見的新生兒腦損傷疾病，主要由胎兒宮內窘迫或胎兒出生時窒息等因素引起，嚴重時表現出新生兒發育遲緩、智力低下，甚至誘發癲癇及患兒死亡，嚴重影響患兒的生活生存質量，給患兒家庭帶來巨大的經濟和精神負擔[8]。目前，臨床對于新生兒缺血缺氧性腦損傷的治療方法和藥物有限，且現有藥物均只能在一定程度上緩解癥狀，表現出有效性低及預后差的特點[9]，所以，目前對于新生兒缺血缺氧性腦損傷治療藥物的研發越來越受關注。

通竅活血湯由麝香、川芎等中藥材組成，方中麝香，活血祛瘀，散瘀止痛，為君藥；桃仁、紅花、赤芍及川芎活血解郁，通達止痛，為臣藥；佐以大棗及生姜，通絡化瘀，溫中補脾，蔥白通陽利竅，調和營衛，為使藥，諸藥合用，共奏通竅活血，散瘀利結之功。現代研究發現，通竅活血湯對于腦損傷及神經損傷均具有顯著的改善作用，賀冠軍[11]研究發現通竅活血湯能夠顯著抑制腦出血患者血腫體積及水腫體積，并能夠促進神經功能的恢復；安聰等[12]研究證實通竅活血湯對于重型顱腦損傷大鼠具有顯著的炎癥抑制作用；杜勇等[13]研究表明，通竅活血湯能夠通過抑制線粒體自噬進而抑制顱腦損傷小鼠腦組織細胞凋亡；練志明等[14]臨床研究證實通竅活血湯能夠顯著促進重型顱腦損傷患者腦血管循環及神經恢復。由此可見通竅活血湯對于缺血缺氧性腦損傷的治療具有較大潛力。

認知障礙是新生兒缺血缺氧性腦損傷的典型臨床表現與并發癥，在臨床藥物治療與藥物研發中成為關鍵考察指標[15]，其中，Morris 水迷宮實驗中靶象限停留時間及穿越平臺次數是反映認知功能的常用指標[16]，本實驗結果發現，通竅活血湯能夠呈劑量依賴性地提高缺血缺氧性腦損傷新生大鼠靶象限停留時間及穿越平臺次數，顯著提高缺血缺氧性腦損傷新生大鼠認知能力及神經功能。腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平是反映腦組織炎癥反應程度的指標，其水平的升高提示腦組織炎癥損傷加重[17]，本實驗表明，通竅活血湯能夠呈劑量依賴性明顯降低缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織TNF-α、IL-1β 及IL-6 水平，抑制腦組織炎癥水平，改善腦組織損傷。

血清sEPCR、sTM、ET-1 水平提示血管內皮功能受損，馬磊等[18]研究證實血清sEPCR 水平升高與大血管病變的發生及進展有關；徐向輝等[19]研究表明降低sTM 水平與改善大鼠血管內皮細胞損傷有關；劉志浩等[20]研究表明降低腦缺血患者ET-1 水平能夠有效改善患者血管內皮功能，促進神經恢復；抑制ET-1 水平能夠顯著抑制血管炎癥損傷，本實驗結果表明，與正常對照組比較，腦損傷組大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 水平明顯升高，而給予不同劑量的通竅活血湯后，大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1 水平明顯降低，提示通竅活血湯能夠呈劑量依賴性地降低缺血缺氧性腦損傷大鼠血清sEPCR、sTM、ET-1水平，抑制血管炎癥反應。同時，血管組織SOD、MDA及TNF-α 水平反映血管炎癥損傷及應激水平，SOD水平降低，MDA 及TNF-α 水平升高提示血管炎癥損傷加重，自我修復能力降低及應激損傷加重[21]，因此，提高血管組織SOD 水平，降低MDA 及TNF-α水平可能是改善腦血管損傷的重要途徑之一。本實驗結果表明，通竅活血湯能夠呈劑量依賴性地抑制血管MDA 及TNF-α 水平，提高SOD 水平，進而抑制血管組織氧化及應激損傷，發揮血管保護作用。

研究證實Nrf2 通路與缺血缺氧性腦損傷的發生及進展密切相關。Shu 等[22]研究發現，Nrf2、HO-1能夠有效抑制氧化應激損傷，進而修復腦損傷后神經功能障礙；馬競等[23]研究表明，升高缺血缺氧性腦損傷大鼠腦組織Nrf2、HO-1 水平能夠顯著促進神經功能恢復，并增強抗氧化作用；魏小于等[24]研究證實JAK2、STAT3 蛋白參與腦組織損傷的發生，而抑制JAK2、STAT3 蛋白水平則能夠顯著抑制腦組織損傷及炎癥反應；劉慶等[25]研究表明Nrf2 能夠通過抑制JAK2、STAT3 蛋白水平，進而抑制炎癥反應及腦神經損傷，抑制和改善腦組織缺血缺氧性腦損傷。由此可見，調節Nrf2 通路及相關蛋白水平可能是治療缺血缺氧性腦損傷的有效途徑和方法。本實驗結果表明，與腦損傷組比較，通竅活血湯能夠劑量依賴性低升高海馬組織Nrf2、HO-1 水平，并抑制JAK2、STAT3 水平，進而促進神經功能改善，抑制腦組織炎癥損傷，促進缺血缺氧性腦損傷大鼠的恢復。

綜上所述，通竅活血湯能夠顯著抑制缺血缺氧性腦損傷大鼠神經損傷及腦組織炎癥反應，抑制血管氧化應激損傷，發揮腦組織及血管保護作用，其機制可能與調節Nrf2 通路有關。