茯苓酸調(diào)節(jié)Hippo 信號(hào)通路對(duì)二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌大鼠的治療作用研究*

石明亮，王曉磊，申洋，朱碩，王航宇

（1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外一科，開封 475000；2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，開封 475000）

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿且進(jìn)展快，多數(shù)患者就診時(shí)已進(jìn)入中晚期或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，致使失去手術(shù)最佳治療機(jī)會(huì)，而因嚴(yán)重的肝功能減退又無法耐受長期放化療，故臨床治療難度大且效果差，患者生存率不高[1-2]。炎癥因子作用于癌癥細(xì)胞引發(fā)的炎癥是癌癥發(fā)生發(fā)展的易感條件，Hippo 作為調(diào)控細(xì)胞再生和器官發(fā)育的保守信號(hào)，可通過調(diào)控炎癥介導(dǎo)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[3]，Yes 相關(guān)蛋白（YAP）作為Hippo 通路的主要關(guān)鍵效應(yīng)物之一，促使YAP 信號(hào)失活可通過調(diào)控免疫與抑制炎癥而抑制腫瘤發(fā)生[4]，Hippo 信號(hào)是肝癌發(fā)生所必需的，阻止其激活可抑制肝癌進(jìn)展并導(dǎo)致其腫瘤消退[5]，由此靶向Hippo 來控制炎癥是肝癌的潛在防治策略。茯苓酸是自利水滲濕藥茯苓中提取的一種蒽酮型三萜化合物，在茯苓中的含量為0.07%～0.09%，具有顯著的抗氧化、抗衰老、抗炎和抗癌等生物學(xué)活性，可抑制不同類型癌癥細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡，能有效降低肝癌細(xì)胞HepG2 和Huh7 的生長和轉(zhuǎn)移潛力[6]，并能抑制腎癌和結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[7-8]，二乙基亞硝胺引發(fā)大鼠免疫異常激活，誘發(fā)肝臟嚴(yán)重炎癥損傷是誘導(dǎo)大鼠肝臟發(fā)生癌變的重要原因，因而推測茯苓酸可能通過其抗炎功效對(duì)DEN 誘導(dǎo)的肝癌發(fā)揮治療作用，本文通過制備DEN 誘導(dǎo)的肝癌大鼠模型，探究茯苓酸調(diào)節(jié)Hippo 信號(hào)通路對(duì)其的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠（7 周齡，體質(zhì)量220～250 g） 采購于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003，于本院維持屏障環(huán)境且溫度為23～25 ℃的動(dòng)物房中飼養(yǎng)，房內(nèi)相對(duì)濕度為50%～60%，光照為黑暗交替進(jìn)行（明暗各12 h）。

1.1.2 主要試劑與儀器 二乙基亞硝胺（DEN）（批號(hào)N109570） 采購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；茯苓酸[純度98.1%，密度（1.1±0.1）g/cm3，沸點(diǎn)（612.2±55.0）℃，760 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa），可溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等有機(jī)溶劑，批號(hào)10015]采購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；氟尿嘧啶（批號(hào)100187-200602）采購于上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；大鼠白細(xì)胞介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒、大鼠IL-17 ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒采購于江蘇科惟生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒采購于上海尚寶生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、LATS1、p-YAP1 及YAP1 一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗采購于美國Abcam 公司等。

全自動(dòng)生化分析儀（型號(hào)BK-200）采購于山東博浩生物科技有限公司；全自動(dòng)冰凍切片機(jī)（型號(hào)HS-4080）采購于濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；倒置生物顯微鏡（型號(hào)AI-WSI3000）采購于廣州微域光學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)Model 680）、小型垂直電泳套裝（型號(hào)Mini-PROTEAN Tetra）采購于美國Bio-Rad 公司等。

1.2 方法

1.2.1 肝癌大鼠模型的建立及分組給藥 以0.9%氯化鈉溶液溶解DEN 制為10 mg/mL 的儲(chǔ)備液備用，取SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組、氟尿嘧啶組，每組10 只，模型組和給藥組大鼠通過腹腔注射DEN 誘導(dǎo)建立肝癌模型，具體方法參照文獻(xiàn)[9]：按5 mL/kg 進(jìn)行腹腔注射，使DEN 注射劑量達(dá)到50 mg/kg，每周注射2 次，連續(xù)注射4 周后改為每周注射1 次，持續(xù)8 周即完成造模，對(duì)照組大鼠腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液，造模大鼠隨機(jī)選出5 只開腹檢測成癌情況，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟形態(tài)腫大且質(zhì)地變硬，表面粗糙并有大量大小不一、密集排布的白色顆粒狀結(jié)節(jié)出現(xiàn)，即可表明肝癌造模成功，造模成瘤率為100%。

以0.9%氯化鈉溶液溶解茯苓酸制為0.35、0.7、1.4 mg/mL 的藥液備用，以0.9%氯化鈉溶液溶解氟尿嘧啶制為5 mg/mL 的藥液備用，各組大鼠均于造模4 周后開始給藥直至造模結(jié)束：茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組大鼠分別腹腔注射0.35、0.7、1.4 mg/mL 的茯苓酸藥液10 mL/kg（使茯苓酸劑量分別達(dá)到3.5、7、14 mg/kg，1 次/d）[10]；氟尿嘧啶組大鼠腹腔注射5 mg/mL 的氟尿嘧啶藥液10 mL/kg（使氟尿嘧啶劑量分別達(dá)到50 mg/kg，每周1 次）[11]；模型組和對(duì)照組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10 mL/kg，各組大鼠均給藥處理8 周。

1.2.2 檢測各組大鼠體質(zhì)量、肝功能、肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積及采集標(biāo)本 首次給藥后稱量各組大鼠體質(zhì)量，記為第0 周，每隔1 周測量1 次體質(zhì)量，直至第4 周給藥結(jié)束；末次給藥后24 h 以乙醚麻醉各組大鼠，采集其尾靜脈血離心（4 ℃、1 000 r/min、10 min，離心半徑20 cm）取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測其中肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平；再次采集尾靜脈血離心（4 ℃、1 000 r/min、10 min，離心半徑20 cm）取血清后將其存在-80℃冰箱保存；稱量各組大鼠體質(zhì)量后開腹取出肝臟，稱出其質(zhì)量后計(jì)算肝臟指數(shù)，公式為：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，計(jì)數(shù)肝臟表面癌結(jié)節(jié)數(shù)量，測量出其中最大癌結(jié)節(jié)長徑a、短徑b 后算出其體積，公式為：最大癌結(jié)節(jié)體積=ab2/2；剪下約0.4 g 肝組織存在液氮內(nèi)，剩余肝組織固定于10%甲醛內(nèi)過夜，然后依次浸泡分級(jí)乙醇（70%、80%、90%、100%）脫水、二甲苯透明及浸蠟包埋，修成小方塊后進(jìn)行連續(xù)切片備用。

1.2.3 HE 染色檢測各組大鼠肝組織病理形態(tài) 肝組織石蠟切片浸泡二甲苯脫蠟、分級(jí)乙醇（100%、90%、80%、70%）水化后用HE 試劑盒內(nèi)染色行HE 染色，然后在倒置生物顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理形態(tài)，并采集切片任意6 個(gè)視野圖像，用Image J軟件定量每個(gè)視野中浸潤的炎性細(xì)胞數(shù)目，取平均值得到各組的炎性細(xì)胞浸潤數(shù)。

1.2.4 測定各組大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α與氧化應(yīng)激因子SOD、CAT、MDA 的水平 各組大鼠血清取出放入冰水浴中提前解凍，采用試劑盒測量其中炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α 與氧化應(yīng)激因子SOD、CAT、MDA 水平，具體步驟參照各自試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠肝組織Hippo信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 各組大鼠肝組織剪碎加入預(yù)冷的RAPI 裂解液內(nèi)，于冰水浴中高速研磨成勻漿液，4 ℃離心（3 000 r/min、20 min，離心半徑20 cm）取上清獲得各組總蛋白樣品液，以BCA 法測出其中蛋白濃度，然后于沸水浴內(nèi)加熱致使蛋白變性，每組取出20 μg 總蛋白樣本通過跑SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，然后通過濕轉(zhuǎn)將其電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，將LATS1、p-YAP1、GAPDH、YAP1 蛋白條帶自膜上剪下，封閉其非特異位點(diǎn)后行抗原抗體反應(yīng)（分別孵育相對(duì)應(yīng)一抗和二抗），經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色后采集各組蛋白條帶圖像，用Quantity One 軟件定量其灰度值后算出各待測蛋白與內(nèi)參GAPDH 蛋白間比值，即得出各組待測蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件行多分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茯苓酸對(duì)大鼠肝功能的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠給藥結(jié)束后體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），血清肝功能指標(biāo)ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠給藥結(jié)束后體質(zhì)量升高（P＜0.05），血清肝功能指標(biāo)ALT、AST 水平降低，且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，給藥結(jié)束后體質(zhì)量與血清肝功能指標(biāo)ALT、AST水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠在給藥期間的體質(zhì)量變化曲線Fig.1 Body weight change curves of rats in each group during administration

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平（±s）Tab.1 SerumALTandASTlevelsofratsineachgroup（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST 水平（±s）Tab.1 SerumALTandASTlevelsofratsineachgroup（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 給藥結(jié)束后體質(zhì)量（g） ALT（U/L） AST（U/L）對(duì)照組 10 497.12±25.38 42.56± 4.84 108.47±10.94模型組 10 190.15±12.31* 145.74±17.21* 301.72±31.24*茯苓酸低劑量組 10 283.57±20.32# 112.43±13.02# 237.56±24.35#茯苓酸中劑量組 10 376.13±21.02#△ 79.10±11.65#△ 172.31±21.82#△茯苓酸高劑量組 10 478.57±20.32#△▲ 45.62± 7.14#△▲115.82±17.43#△▲氟尿嘧啶組 10 482.34±22.30#△▲ 44.28± 6.79#△▲112.90±15.61#△▲

2.2 茯苓酸對(duì)大鼠肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積降低，且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠肝臟及腫瘤大體觀察Fig.2 Gross observation of liver and tumor of rats in each group

表2 各組大鼠肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積（±s）Tab.2 Liver index，number of liver surface cancer nodules，and maximum cancer nodule volume of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、最大癌結(jié)節(jié)體積（±s）Tab.2 Liver index，number of liver surface cancer nodules，and maximum cancer nodule volume of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

最大癌結(jié)節(jié)體積（mm3）對(duì)照組 10 2.37±0.32 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 10 6.61±0.43* 14.20±1.50* 310.97±36.35*茯苓酸低劑量組 10 5.21±0.34# 9.80±0.93# 242.65±24.33#茯苓酸中劑量組 10 4.02±0.26#△ 5.40±0.72#△ 169.21±15.17#△茯苓酸高劑量組 10 2.79±0.31#△▲ 0.90±0.20#△▲ 98.39±11.82#△▲氟尿嘧啶組 10 2.58±0.30#△▲ 0.60±0.18#△▲ 81.20±9.50#△▲組別 動(dòng)物數(shù) 肝臟指數(shù)（%）肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)（個(gè)）

2.3 茯苓酸對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)的影響 對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝組織無病理損傷；模型組大鼠肝組織發(fā)生癌變：肝小葉結(jié)構(gòu)受損被分割，肝細(xì)胞大小不一且變性壞死，可見細(xì)胞核且呈雙核、多核等病理性分裂象的肝癌細(xì)胞大量增加，并呈巢狀、梁狀或灶狀排列，瘤灶內(nèi)伴有炎癥細(xì)胞浸潤，模型組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)相比對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠肝組織上述癌變癥狀均減輕，且癌變減輕程度隨茯苓酸劑量升高而增強(qiáng)，炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)降低且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，肝組織癌變減輕程度無明顯差異，炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠肝組織病理形態(tài)（×200）Fig.3 Pathological morphology of liver tissue of rats in each group(×200)

表3 各組大鼠肝組織炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)（±s）Tab.3 Number of inflammatory cell infiltration in liver tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠肝組織炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)（±s）Tab.3 Number of inflammatory cell infiltration in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) 炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)（個(gè)）對(duì)照組 10 9.13±2.94模型組 10 54.81±5.23*茯苓酸低劑量組 10 40.35±4.01#茯苓酸中劑量組 10 27.02±3.34#△茯苓酸高劑量組 10 14.13±2.81#△▲氟尿嘧啶組 10 11.20±3.02#△▲

2.4 茯苓酸對(duì)大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平降低，且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平（±s）Tab.4 Serum IL-6，IL-17，and TNF-α levels of rats in each group（±s） pg/mL

表4 各組大鼠血清IL-6、IL-17、TNF-α 水平（±s）Tab.4 Serum IL-6，IL-17，and TNF-α levels of rats in each group（±s） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) IL-6 IL-17 TNF-α對(duì)照組 10 94.69±13.46 13.78± 1.38 26.97± 3.81模型組 10 295.48±26.21* 82.95±12.43* 152.74±17.25*茯苓酸低劑量組 10 226.37±18.12# 58.52± 7.35# 112.82±15.34#茯苓酸中劑量組 10 161.20±15.39#△ 37.89± 5.46#△ 72.13±11.46#△茯苓酸高劑量組 10 105.13±11.03#△▲16.17± 3.20#△▲31.11± 6.62#△▲氟尿嘧啶組 10 99.21±9.57#△▲ 14.91± 2.65#△▲28.95± 4.05#△▲

2.5 茯苓酸對(duì)大鼠血清氧化應(yīng)激因子SOD、CAT、MDA 水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清SOD、CAT 水平顯著降低（P＜0.05），MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠血清SOD、CAT 水平升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05），且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，血清SOD、CAT、MDA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清SOD、CAT、MDA 水平（±s）Tab.5 Serum SOD，CAT，and MDA levels of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠血清SOD、CAT、MDA 水平（±s）Tab.5 Serum SOD，CAT，and MDA levels of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) SOD（U/mL） CAT（U/mL） MDA（nmol/L）對(duì)照組 10 115.43±6.14 4.98±0.40 5.42±0.53模型組 10 76.62±4.05* 2.15±0.21* 11.36±0.80*茯苓酸低劑量組 10 87.97±4.28# 2.90±0.19# 9.43±0.65#茯苓酸中劑量組 10 99.16±5.01#△ 3.81±0.17#△ 7.54±0.46#△茯苓酸高劑量組 10 112.08±5.40#△▲ 4.67±0.13#△▲ 5.80±0.42#△▲氟尿嘧啶組 10 113.12±4.96#△▲ 4.79±0.15#△▲ 5.61±0.37#△▲

2.6 茯苓酸對(duì)大鼠肝組織Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織LATS1 蛋白表達(dá)及p-YAP1/YAP1 顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低、中、高劑量組、氟尿嘧啶組大鼠肝組織LATS1 蛋白表達(dá)及p-YAP1/YAP1 降低（P＜0.05），且茯苓酸各組呈劑量依賴性（P＜0.05）；茯苓酸高劑量組與氟尿嘧啶組大鼠比較，LATS1 蛋白表達(dá)及p-YAP1/YAP1 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、表6。

圖4 各組大鼠肝組織Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.4 Hippo signaling pathway related protein expression in liver tissue of rats in each group

表6 各組大鼠肝組織Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)（±s）Tab.6 Relative expression of Hippo signaling pathway related proteins in liver tissue of rats in each group（±s）

表6 各組大鼠肝組織Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)（±s）Tab.6 Relative expression of Hippo signaling pathway related proteins in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與茯苓酸低劑量組比較，△P＜0.05；與茯苓酸中劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù) LATS1/GAPDH p-YAP1/YAP1對(duì)照組 10 0.15±0.02 0.07±0.01模型組 10 1.33±0.13* 0.98±0.14*茯苓酸低劑量組 10 0.98±0.09# 0.69±0.08#茯苓酸中劑量組 10 0.59±0.07#△ 0.40±0.05#△茯苓酸高劑量組 10 0.19±0.05#△▲ 0.10±0.02#△▲氟尿嘧啶組 10 0.17±0.04#△▲ 0.09±0.01#△▲

3 討論

目前中國肝癌發(fā)病率年年上升，如今已成為排在第2 位的造成癌癥性死亡的惡性腫瘤，臨床主要以化學(xué)藥物進(jìn)行治療，但存在諸如不良反應(yīng)大、易產(chǎn)生耐藥性等局限性，因此要提高肝癌患者生存率和生活質(zhì)量還需探尋更有效且安全的新型藥物[12-13]。本文采用腹腔注射DEN 誘導(dǎo)建立肝癌大鼠模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清SOD、CAT 水平顯著降低，血清ALT、AST、IL-6、IL-17、TNF-α 與MDA 水平、肝組織炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)顯著升高，表明DEN 引發(fā)大鼠體內(nèi)嚴(yán)重炎癥與氧化應(yīng)激，揭示炎癥及氧化應(yīng)激引起的肝組織損傷是DEN 誘導(dǎo)肝癌的重要病理基礎(chǔ)。

茯苓是一種利水滲濕類中藥，具有安神、寧心、健脾、利水、滲濕的功能，茯苓酸作為茯苓的主要活性成分之一，可發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的藥理作用，能呈劑量依賴性地降低宮頸癌細(xì)胞活力并抑制其在裸鼠體內(nèi)生長[6，14]，還可用于肺癌的治療，降低肺癌細(xì)胞活性及其耐藥蛋白表達(dá)[15]，并可顯著抑制肝癌細(xì)胞生長、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移[6]，因而推測茯苓酸可能用于治療肝癌。本文以不同劑量茯苓酸處理DEN 誘導(dǎo)的肝癌大鼠，可升高大鼠血清SOD、CAT 水平并降低其血清ALT、AST、IL-6、IL-17、TNF-α 與MDA 水平、炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)，與文獻(xiàn)[10]研究結(jié)果相似，證實(shí)了茯苓酸具有抗炎功效，但本文還表明茯苓酸可增強(qiáng)抗氧化酶活性，對(duì)DEN 誘發(fā)的炎癥和氧化應(yīng)激起到明顯抑制作用；茯苓酸還可升高DEN 誘導(dǎo)的肝癌大鼠體質(zhì)量，減輕其肝組織癌變癥狀，降低其肝臟指數(shù)、肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤質(zhì)量，且呈劑量依賴性，與文獻(xiàn)[6，14-15]研究結(jié)果相似，證實(shí)了茯苓酸具有抗癌活性，且表明了茯苓酸可減輕DEN 誘導(dǎo)的大鼠肝組織癌變癥狀，減少其肝組織內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)形成，改善大鼠肝功能，最終發(fā)揮明顯的抗癌作用，且劑量越高，作用越強(qiáng)，揭示茯苓酸在肝癌的防治中具有很高的研發(fā)應(yīng)用潛力。

Hippo 是重要的致癌信號(hào)，在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中處于異常激活狀態(tài)，抑制其激活可減輕結(jié)直腸癌的生長和肝轉(zhuǎn)移[16]，研究顯示刺激Hippo 信號(hào)激活可促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的干性和化療耐藥性的產(chǎn)生，抑制Hippo 信號(hào)傳導(dǎo)可顯著降低肝細(xì)胞癌的干細(xì)胞特性和索拉非尼、樂伐替尼耐藥性，增強(qiáng)化療藥物對(duì)體內(nèi)腫瘤的消退作用，最終對(duì)肝癌發(fā)揮顯著抗癌功效[5，17]。本文結(jié)果顯示，DEN 誘導(dǎo)的肝癌大鼠肝組織Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白LATS1 表達(dá)及YAP1 磷酸化顯著升高，而不同劑量茯苓酸處理的大鼠肝組織LATS1 蛋白表達(dá)及YAP1 磷酸化相比肝癌模型大鼠降低，表明Hippo 信號(hào)參與介導(dǎo)DEN 誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生發(fā)展過程，且茯苓酸延緩DEN 誘導(dǎo)的大鼠肝癌發(fā)生時(shí)可抑制Hippo 信號(hào)激活，揭示茯苓酸治療DEN 誘導(dǎo)的肝癌大鼠的分子機(jī)制可能是阻止Hippo 信號(hào)激活，本文首次證實(shí)了Hippo 信號(hào)參與茯苓酸對(duì)DEN 誘導(dǎo)的肝癌大鼠的治療過程，對(duì)于臨床研發(fā)茯苓酸的肝癌治療方案提供了新的理論依據(jù)，并可發(fā)揮一定積極作用。

綜上所述，茯苓酸可降低Hippo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白LATS1 表達(dá)及YAP1 磷酸化，阻止DEN 誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，抑制大鼠肝組織癌變及肝組織內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)形成，修復(fù)其肝功能，對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝癌大鼠起到顯著的治療作用，抑制Hippo信號(hào)激活可能是藥理機(jī)制之一，本文為臨床治療肝癌提供了新的治療思路和藥物候選，有助于患者預(yù)后的改善，但本文對(duì)茯苓酸治療肝癌的藥理機(jī)制只進(jìn)行了初步研究，其證據(jù)效力存在一定不足，后續(xù)需要用Hippo 信號(hào)激活劑和抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來作對(duì)照驗(yàn)證。