黃芪多糖減輕糖尿病性肌少癥大鼠肌肉萎縮的作用機制研究*

孔一晗，劉信邦，常柏，王娟

（天津醫科大學朱憲彝紀念醫院、天津市內分泌研究所、國家衛生健康委員會激素與發育重點實驗室、天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134）

近年來，糖尿病的發病率逐漸上升，預計到2045 年，全球糖尿病患者將達到7 億[1]，在中國，60 歲以上人群的糖尿病患病率為14.7%[2]，糖尿病常伴發各種并發癥，除糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等常見的并發癥之外，糖尿病合并肌少癥也是值得關注的問題。骨骼肌約占人體總質量的40%，是人體重要組織和代謝器官，不僅能夠維持身體姿勢和參與運動，在糖代謝過程中也發揮著重要作用。肌少癥是一種以骨骼肌肌力、耐力以及質量下降，影響生活質量，甚至造成殘疾乃至死亡的退行性綜合征[3-4]。

糖尿病患者因內分泌代謝紊亂、血管病變及神經病變等因素，易合并肌少癥，造成肌肉萎縮等不良后果[5]，同時，肌少癥的發生又可通過影響血糖調節、機體代謝等途徑加速糖尿病的發生發展[6]。在高糖狀態下，骨骼肌中的micro RNA-106 表達量上升，而自噬能力下降，加劇脂肪在骨骼肌中的沉積，導致肌萎縮的出現[7]。此外，發生肌萎縮的組織中衛星細胞數量減少，肌肉與周圍肌腱韌帶的連接減弱，關節生物力學發生改變，對生活質量造成影響[8]?，F代醫學研究發現，2 型糖尿病患者合并肌少癥的比例高達18%[9]，因此對于糖尿病合并肌少癥的研究刻不容緩。

目前，對于糖尿病合并肌少癥的治療尚不完善，除了營養支持、運動療法等預防性的手段，西醫藥物治療也存在一些局限性[10]。中醫認為，“脾不散精”是糖尿病患者血糖異常升高的重要環節[11]，而肌少癥屬于痿癥，脾主肌肉[12]，因此糖尿病合并肌少癥的治療多從補氣健脾、益氣養陰層面開展。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，近年來相關研究發現黃芪多糖具有抗炎、抗衰老、降低血糖、免疫調節等多種作用[13]，其性味甘微溫，歸脾、肺兩經，兼具補氣健脾、斂瘡生肌、利尿排膿之功效[14]，其應用于糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變等常見并發癥已有相關報道，但對于治療糖尿病合并肌少癥的研究少之又少，因此本文將通過動物實驗探究黃芪多糖對糖尿病相關性肌少癥的治療效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠（雄性，8 月齡），許可證號：SCXK（京）2019-0010，來自北京斯貝福生物技術有限公司，SPF 級，體質量（400±50）g，飼養于天津醫科大學朱憲彝紀念醫院實驗動物中心，濕度60%～80%，溫度18～23 ℃，給予充分光照，此次動物實驗通過了天津醫科大學朱憲彝紀念醫院的動物實驗倫理委員會批準（批號：DXBYY-IACUC-2021054）。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）；離心機（Eppendorf）；蛋白電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。試劑：PCR 試劑盒購自北京全式金生物公司；Trizol 總RNA 提取試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、鏈脲佐菌素（STZ）由索萊寶提供；預染蛋白Marker 由Thermo 提供；PAGE 凝膠快速制備試劑盒購自雅酶生物；黃芪多糖來自羅恩公司；鹽酸二甲雙胍購于中美上海施貴寶制藥有限公司（國藥準字H20023370），抗體購自Sigma 公司；引物來自擎科生物，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2 方法

1.2.1 造模及給藥 SD 大鼠分為4 組，每組6 只，分別為正常組、模型組、黃芪多糖組、二甲雙胍組，除正常組以外，根據相關文獻，其余3 組于適應性喂養1 個月后按55 mg/kg 的劑量一次性腹腔注射STZ 制備糖尿病大鼠模型，注射7 d 后連續3 d 血糖＞16.7 mmol/L 代表造模成功。之后進行分組灌胃給藥，根據相關文獻及前期實驗總結，黃芪多糖組每日給予800 mg/kg 的黃芪多糖灌胃[15]、西藥二甲雙胍組每日給予105 mg/kg 的二甲雙胍灌胃，正常及模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 大鼠給藥3 個月后麻醉處死，取腓腸肌組織進行包埋、切片、HE 染色，在全自動掃描儀上觀察腓腸肌形態并留存圖像。

1.2.3 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測 將腓腸肌組織放于-80 ℃，提前配置好凝膠，取部分組織進行蛋白提取，上樣電泳結束后進行轉膜，牛奶封閉、TBST 緩沖液搖動清洗，一抗4 ℃孵育過夜、二抗孵育，最后在暗箱進行條帶曝光并保存。

1.2.4 PCR 檢測 利用Trizol 提取RNA，逆轉錄試劑盒進行c-DNA 轉錄，并設置相應的反應條件。q-PCR 體系配置，離心后放入PCR 儀進行循環，記錄CT 值等數據進行下一步的分析。

1.2.5 血清檢測 大鼠麻醉處死后立即眼球取血，離心分離血清，采用院內檢驗科全自動生化分析儀進行三酰甘油（TG）檢測。

1.3 統計學分析 數據采用SPSS 22.0 進行分析，所有計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腓腸肌HE 染色 如圖1 所示，正常組肌肉細胞飽滿、細胞間距較小、無異常形態；模型組發生明顯萎縮、橫截面積變小，細胞間距增大、稀疏，有部分滲出及炎性浸潤表現，如箭頭所示；黃芪多糖組較模型組有顯著改善，肌肉細胞面積增大，炎性狀態大大減輕；二甲雙胍組也在模型組的基礎上有一定程度的恢復，但改善程度不如黃芪多糖組。

圖1 各組腓腸肌HE 染色形態圖（×40）Fig.1 HE staining pattern of gastrocnemius muscle of each group (×40)

2.2 磷酸化蛋白激酶B（P-AKT）/蛋白激酶B（AKT）、叉頭框轉錄因子O 亞族1（FOXO1）的Western Blot蛋白表達 由圖2、表2 所示，P-AKT 與AKT 蛋白分子量在模型組均較正常組有所降低，黃芪多糖組和二甲雙胍組較模型組有所增加，且黃芪多糖組增加更為明顯（P＜0.05）。模型組FOXO1 的蛋白分子量較正常組顯著下降（P＜0.05），黃芪多糖組和二甲雙胍組比模型組明顯增加（P＜0.05），且藥物干預的兩組比較差異沒有統計學意義。

圖2 P-AKT/ AKT、FOXO1 的蛋白表達Fig.2 Relative protein expression of P-AKT/AKT，FOXO1 in each group

表2 各組蛋白相對表達量（±s）Tab.2 Relative protein expression of P-AKT/AKT，FOXO1 in each group（±s）

表2 各組蛋白相對表達量（±s）Tab.2 Relative protein expression of P-AKT/AKT，FOXO1 in each group（±s）

注：正常組相比，#P＜0.05；與模型組相比，*P＜0.05。

組別 動物數 PAKT/AKT FOXO1正常組 6 0.89±0.21 0.78±0.61模型組 6 0.54±0.40# 0.41±0.43#黃芪多糖組 6 0.85±0.37* 0.84±0.33*二甲雙胍組 6 0.72±0.32 0.83±0.43*

2.3 各組PCR 數據分析 與正常組相比，模型組、熱休克轉錄因子1（HSF1）、白細胞介素（IL-6）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）抑癌基因TP53 mRNA 水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，黃芪多糖組的MMP-9、TP53 水平顯著降低（P＜0.01），HSF1、IL-6 水平明顯降低（P＜0.05）；二甲雙胍各個指標均較模型組有所下降，其中MMP-9 下降水平最為明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3。

表3 各組HSF1、IL-6、MMP-9 和TP53 mRNA 的表達量（±s）Tab.3 Expression of HSF1，IL-6，MMP-9 and TP53 mRNA in each group（±s）

表3 各組HSF1、IL-6、MMP-9 和TP53 mRNA 的表達量（±s）Tab.3 Expression of HSF1，IL-6，MMP-9 and TP53 mRNA in each group（±s）

注：與正常組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數 HSF1 IL-6 MMP-9 TP53正常組 6 1.03±0.29 1.01±0.06 1.00±0.10 1.10±0.06模型組 6 4.04±0.84## 2.52±0.43## 4.91±0.28## 1.90±0.29##黃芪多糖組 6 1.86±0.33* 1.38±0.19* 1.50±0.39** 0.92±0.22**二甲雙胍組 6 2.34±0.49* 1.58±0.17* 3.28±0.24** 1.26±0.07*

2.4 血清生化指標TG 模型組TG 水平明顯高于正常組（P＜0.01），黃芪多糖組與二甲雙胍組相較于模型組血脂狀態均有改善，TG 水平有所降低，其中二甲雙胍組TG 水平改善較為顯著，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 各組TG 水平（±s）Tab.4 TG values of each group（±s） mmol/L

表4 各組TG 水平（±s）Tab.4 TG values of each group（±s） mmol/L

注：與正常組相比，##P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

組別 動物數 TG正常組 6 2.45±0.88模型組 6 5.60±0.81##黃芪多糖組 6 2.26±0.36**二甲雙胍組 6 0.72±0.20**

3 討論

糖尿病作為一種慢性消耗性疾病，常合并多種并發癥，近年來有些研究指出，肌少癥成為了糖尿病人群，尤其是老年糖尿病人群的新的并發癥[16]。合并肌少癥的患者會因肌力下降、肌肉萎縮等病理過程嚴重影響日?；顒?，造成意外傷害而致殘乃至死亡，正日益成為糖尿病患者面臨的又一項挑戰。

本次實驗選用了大月齡SD 鼠作為研究對象，并進行一次性STZ 注射造模，以符合老年糖尿病模型的設計初衷。腓腸肌作為人體進行站立、步行等活動的重要骨骼肌，受肌少癥影響較為顯著，對大鼠腓腸肌的HE 染色發現，糖尿病組的肌細胞明顯發生了萎縮、滲出，細胞間隙變大，說明高糖毒性對腓腸肌的消耗較為嚴重，這與張艷等[17]的實驗結果相似。經黃芪多糖灌胃治療3 個月后的腓腸肌有所改善，可見肌細胞相比于模型組更加飽滿，變性滲出也大面積減少，效果優于二甲雙胍組。PI3K-AKTFOXO1 信號通路是糖尿病研究的重要通路機制之一[18]，Western Blot 結果表明，模型組P-AKT/AKT 水平較正常組明顯降低[19]，AKT 作為糖尿病的保護因子，高糖狀態降低了其含量[20-21]，經中藥干預后含量顯著增加。FOXO1 是一種叉頭框轉錄因子，O’Neill等[22]實驗證明FOXO 是糖尿病相關肌萎縮的關鍵調節因子，恰恰印證了模型組FOXO1 含量的下降，而經過藥物干預的兩組均出現了FOXO1 含量的上升，且相差不大，效果相當，考慮黃芪多糖和二甲雙胍均可能通過調控FOXO 轉錄因子減輕高糖毒性并改善肌萎縮狀態[23]。聚合酶鏈PCR 實驗驗證了黃芪多糖和二甲雙胍對IL-6、TP53 炎癥因子的改善作用，相比之下，黃芪多糖減輕程度要優于西藥，這與Giha 等[24-26]文章不謀而合。相關實驗表明HSF1參與糖尿病的相關進程[27]，在本實驗中糖尿病組HSF1 mRNA 表達量明顯提高，黃芪多糖組相較于模型組明顯降低。MMP-9 主要功能是降解和重塑細胞外基質之間的動態平衡，有研究發現糖尿病合并下肢病變的人群MMP-9 水平明顯提高[28]，說明MMP-9 可能通過影響下肢血液循環造成肌肉萎縮，與實驗結果一致。糖尿病大鼠生化指標TG 較正常組明顯升高，二甲雙胍的降脂作用要優于黃芪多糖組。

黃芪多糖是黃芪中的重要成分之一，近年來有不少致力于研究黃芪多糖對糖尿病及其并發癥的治療作用的文章。本次實驗采用黃芪多糖對糖尿病性肌少癥進行干預，通過肌肉形態的HE 染色、Western Blot、PCR 等實驗驗證了黃芪多糖對糖尿病及肌肉萎縮的改善作用。黃芪多糖由多種單糖及葡聚糖（Glu）構成，有研究指出，β-Glu 可以作為生物反應調節劑增強免疫功能，從而改善高糖狀態，減輕肌肉萎縮[29]。相關研究發現，黃芪多糖可以糾正因糖尿病導致的輔助性T 淋巴細胞（Th）的失衡，保護胰腺的超微結構，減輕凋亡及炎癥水平[30]，這也可能是導致肌肉萎縮減輕的作用機制。此外，黃芪多糖能夠上調抗氧化因子減輕氧化應激水平[31]，并且顯著增強抗氧化基因表達，降低了胰島素樣肽和長壽基因MTH 的表達，從而延緩各組織器官的萎縮機體的衰老[32]。葉婷等[15]證明黃芪多糖通過調節自噬改善糖尿病心肌病；有研究發現黃芪多糖能降低空腹血糖、減輕胰島素抵抗從而改善血管動脈粥樣硬化[33]。黃芪多糖還可通過下調心肌p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）/p65 的磷酸化水平減輕心肌纖維化[25]；另外有實驗證明[34-36]，黃芪多糖通過調節PI3K-AKT 途徑及炎性因子發揮作用，減輕高糖狀態及各種糖尿病并發癥，與本次實驗部分結果相一致。

綜上所述，實驗結果表明黃芪多糖可能通過調節PI3K-AKT-FOXO1 信號通路、降低IL-6、TP53炎性因子水平，影響HSF1 和MMP-9 的活性，從而改善糖尿病性肌少癥大鼠的肌肉萎縮。