優化潰結方對潰瘍性結腸炎氣滯血瘀模型大鼠的影響及其作用機制研究

張帥，李娜，沈江立，柳越冬，吳憲樹，王磊，盛天驕，徐紅俊，安勝軍*

1.050091 河北省石家莊市，河北中醫藥大學

2.712000 陜西省咸陽市中心醫院

3.110005 遼寧省沈陽市，遼寧中醫藥大學附屬第三醫院

4.021008 內蒙古自治區呼倫貝爾市中蒙醫院肛腸科

5.110005 遼寧省沈陽市，解放軍北部戰區總醫院中醫科

相關統計資料顯示，近年來我國潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）患者數量持續增加，發病率約為13.3/100 萬［1］。對于UC，臨床常采用氨基水楊酸類、糖皮質激素類藥物等進行治療，雖然其近期療效尚可，但不良反應較大，且經治療后容易復發。優化潰結方由黃芪、（炒）白術、蒼術、青黛、敗醬草、白頭翁、紅花組成，是柳越冬教授用以治療UC 脾虛濕熱證的經驗方，療效確切、證據成鏈［2-5］。實驗研究表明，優化潰結方可有效改善UC 模型大鼠癥狀，并通過調節細胞外信號調節激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）、白介素1β 等改善腸道炎癥［3］；網絡藥理學研究表明，優化潰結方對腸道免疫應答的調控涉及白介素17 免疫信號通路、Toll 樣受體信號通路［4-6］。此外，優化潰結方含有益氣活血的常用對藥黃芪和紅花，但其對UC 氣滯血瘀型患者的作用機制尚不明確。本研究旨在探討優化潰結方對UC 氣滯血瘀模型大鼠的影響，并通過比較干預后大鼠結腸組織趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、轉化生長因子激酶1（transforming growth factor kinase 1，TAK1）表達水平而探索其作用機制，以期為臨床應用優化潰結方治療UC 氣滯血瘀型患者提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

2023 年9—10 月，選取體質量為200～240 g 的SPF級雄性SD 大鼠70 只（西安交通大學醫學實驗動物中心提供，合格證號：2018-001），采用隨機數字表法將其隨機分為正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標準劑量組、益氣組、活血組，每組10 只。所有大鼠飼養于清潔系統內，室溫保持在（20±2）℃，相對濕度保持在50%～60%；大鼠的飼養及觀察均在咸陽市中心醫院實驗中心進行；本實驗方案經陜西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審議并批準（審批號：SUCMDL20231316003）。

1.2 UC 氣滯血瘀型模型的建立

采用三硝基苯磺酸（thiobarbituric acid reactive substances，TNBS）/乙醇二次致炎法結合束縛法［2］建立UC 氣滯血瘀模型：大鼠適應性飼養1 周后限制其四肢活動度（約8 h/d），造模前禁食不禁水24 h，稱重后采用戊巴比妥鈉3 mL/kg 進行麻醉，然后將灌胃針自大鼠肛門插至距肛門8 cm 處，采用60 mg/kg TNBS/乙醇溶液緩慢灌腸以誘導急性結腸炎；15 d 后（造模第16 天）采用同樣方法進行30 mg/kg TNBS/乙醇溶液灌腸以誘導復發性結腸炎。需要注意的是，兩次灌腸后均需注入空氣0.5 mL 并使大鼠保持倒立位3～5 min，然后放回飼養籠并保持仰臥位、正常飼養，造模過程中大鼠若有死亡則及時補足。依據大鼠血液流變學指標、疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分驗證UC 氣滯血瘀模型大鼠造模是否成功［2］。

1.3 優化潰結方的制備

本研究所用柳氮磺胺吡啶由上海福達制藥有限公司生產，用量為6 g，使用前需加水浸泡一段時間并濃縮、定容至6 mL，之后灌入清潔玻璃容器中，封口、經高壓滅菌后于4 ℃條件下冷藏備用，此時柳氮磺胺吡啶藥液濃度為1 g/mL。

優化潰結方藥物組成：黃芪20 g、（炒）白術15 g、蒼術10 g、青黛3 g、敗醬草20 g、白頭翁15 g、紅花10 g。自咸陽市中心醫院中藥房購買上述中藥材后加水浸泡45 min，文火煎煮40 min 后濾取藥液，然后加入藥渣同體積水繼續煎煮30 min 并再次濾取藥液，將2 次所得濾液混合并濃縮、定容至93 mL，之后灌入清潔玻璃容器中，封口、經高壓滅菌后于4 ℃條件下冷藏備用，此時優化潰結方藥液濃度為1 g/mL。60 kg 人與200 g 大鼠藥物劑量折算比為 6.25∶1，據此換算得出優化潰結方標準劑量為1.674 g·kg-1·d-1［6-7］。

單獨自咸陽市中心醫院中藥房購買黃芪、紅花各10 g，各加水浸泡30 min，文火煎煮40 min 后濾取藥液，然后加入藥渣同體積水繼續煎煮30 min 并再次濾取藥液，各將2 次所得濾液混合并濃縮、定容至10 mL，之后灌入清潔玻璃容器中，封口、經高壓滅菌后于4 ℃條件下冷藏備用，此時黃芪、紅花藥液濃度均為1 g/mL。

1.4 干預方法

正常組大鼠在造模時使用0.9%氯化鈉溶液灌腸，并與其他組大鼠進行同步抓取、固定，在造模成功后給予等體積水灌胃，1 次/d，共灌胃14 次；模型組大鼠在造模成功后給予等體積水灌胃，1 次/d，共灌胃14 次；柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標準劑量組、益氣組、活血組大鼠分別在造模成功后給予柳氮磺胺吡啶藥液0.54 g/kg、低劑量優化潰結方藥液0.837 g/kg、標準劑量優化潰結方藥液1.674 g/kg、黃芪藥液1.8 g/kg、紅花藥液0.9 g/kg 灌胃，均為1 次/d，均灌胃14 次。

1.5 大鼠結腸組織超微結構變化

造模后第15 天處死7 組大鼠并鉗取其結腸組織2～3 塊（大小：1 mm×1 mm×1 mm），采用2.5%戊二醛、1%鋨酸依次固定，切片后采用高精度透射電鏡觀察結腸組織超微結構變化并攝片、保存。

1.6 大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達水平

采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達水平：將鉗取的大鼠結腸組織塊用預冷的磷酸鹽（PBS）緩沖液洗滌數次后剪成小塊（大小：1 mm×1 mm）并置于勻漿管中，再放入1～2 個3 mm 的勻漿珠并倒入提前制備的10 倍于結腸組織塊體積的裂解液，并進行勻漿處理；若要制備高濃度蛋白，放入少量裂解液即可。上述操作結束后及時取出勻漿管，放置于冰上0.5 h，每隔3～5 min 震蕩1 次以使樣本充分裂解，然后于4 ℃條件下低速離心10 min，離心力為14000×g；最后收集蛋白溶液并進行濃度測定、蛋白變性、電泳等。大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達水平以灰度比值表示。

1.7 大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA表達水平

采用熒光定量PCR 檢測大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 表達水平：將大鼠結腸組織勻漿、研磨后提取總RNA，測定濃度及純度后進行反轉錄及PCR 檢測；采用2-??Ct法計算CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量，CXCR4、VEGFA、TAK1 PCR 引物序列見表1。

表1 CXCR4、VEGFA、TAK1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences of CXCR4，VEGFA and TAK1

1.8 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析并進行方差齊性檢驗，方差齊時兩兩比較采用LSD-t 分析，方差不齊時采用非參數檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸組織超微結構變化

造模后第15 天正常組大鼠腸上皮細胞未見明顯腫脹，細胞膜完整，胞內基質電子密度均一，細胞器豐富；微絨毛排列整齊，局部區域稀疏；腸屏障結構尚可；胞核異染色質增加，核膜模糊；線粒體數量適中，結構尚可；粗面內質網未見明顯擴張（圖1A）。

圖1 7 組大鼠造模后第15 天結腸組織超微結構變化（投射電鏡，×5000）Figure 1 Change of ultra microstructure in colonic tissue in the seven groups after 15 days of the establishing

造模后第15天模型組大鼠腸上皮細胞中重度水腫，細胞器豐富、明顯腫脹；微絨毛局部稀疏、紊亂、大量缺失，部分明顯腫脹；細胞間緊密連接及中間連接結構不明顯，未見明顯橋粒結構，細胞間隙明顯增加（圖1B 箭頭所示），腸屏障結構異常。

造模后第15 天柳氮磺胺吡啶組大鼠腸上皮細胞未見明顯腫脹，細胞膜完整，胞內基質電子密度均一，細胞器豐富；微絨毛排列整齊，長短均一；細胞間緊密連接結構模糊，中間連接張力絲少量減少，橋粒數量豐富（圖1C）。

造模后第15天低劑量組大鼠腸上皮細胞輕度腫脹，細胞膜完整，胞內基質電子密度均一，細胞器豐富；微絨毛排列整齊，數量豐富，略顯腫脹；細胞間緊密連接、中間連接及橋粒局部可見、結構清晰，腸屏障結構受損（圖1D）。

造模后第15 天標準劑量組大鼠腸上皮細胞線粒體數量適中、未見明顯腫脹、基質較為均勻，個別腫脹線粒體基質較多溶解；粗面內質網未見明顯擴張、表面可見核糖體附著，腸屏障結構尚可（圖1E）。

造模后第15 天益氣組大鼠腸上皮細胞中度水腫，微絨毛略顯腫脹，排列不整齊，普遍較短；細胞間緊密連接及中間連接結構模糊，細胞間隙狹窄，連接復合體結構正常，腸屏障結構尚可；部分基質較多溶解，嵴部分斷裂、消失（圖1F）。

造模后第15 天活血組大鼠腸上皮細胞未見明顯腫脹，細胞膜完整，胞質內細胞器豐富、結構正常；微絨毛排列整齊、長短均一，無明顯萎縮、脫落，局部區域略顯稀疏；細胞間可見緊密連接、中間連接、橋粒，多處細胞間隙明顯增寬（圖1G 箭頭所示），連接復合體張力微絲略減少。

2.2 大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白表達水平

7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1蛋白灰度比值比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2、表2。模型組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值高于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）；柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標準劑量組、益氣組、活血組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）；標準劑量組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值低于柳氮磺胺吡啶組，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖2 7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

表2 7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值（±s）Table 2 Comparison of gray ratios of proteins of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

表2 7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值（±s）Table 2 Comparison of gray ratios of proteins of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

注：a 表示與正常組相比P<0.05；b 表示與模型組相比P<0.05；c 表示與柳氮磺胺吡啶組相比P<0.05。

組別 只數 CXCR4 VEGFA TAK1正常組 101.27±0.030.87±0.170.98±0.29模型組 101.90±0.06a 1.46±0.27a 1.94±0.52a柳氮磺胺吡啶組 101.51±0.18ab 0.98±0.27b 1.58±0.48ab低劑量組 100.36±0.14abc 0.10±0.09abc 1.03±0.26bc標準劑量組 100.10±0.09abc 0.05±0.06abc 0.74±0.18abc益氣組 101.09±0.08abc 0.40±0.25abc 1.45±0.10ab活血組 101.50±0.15ab 1.10±0.20ab 1.50±0.09ab F 值 989.373203.94253.058 P 值 <0.001 <0.0010.001

2.3 大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA表達水平

7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。模型組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量高于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）；低劑量組、標準劑量組、益氣組、活血組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA相對表達量低于模型組，活血組大鼠干預后結腸組織VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量低于柳氮磺胺吡啶組，差異有統計學意義（P<0.05）。

表3 7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 3 Comparison of relative mRNA expression quality of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

表3 7 組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 3 Comparison of relative mRNA expression quality of CXCR4，VEGFA and TAK1 in colonic tissue in the seven groups after intervention

注：a 表示與正常組相比P<0.05；b 表示與模型組相比P<0.05；c 表示與柳氮磺胺吡啶組相比P<0.05。

組別 只數 CXCR4 VEGFA TAK1正常組 1021.13±0.1225.75±0.4922.31±0.43模型組 1033.88±1.19a 37.40±0.79a 33.43±0.81a柳氮磺胺吡啶組 1021.34±0.26b 27.48±0.28ab 23.14±0.76ab低劑量組 1021.21±1.11b 25.94±0.63bc 23.06±0.67ab標準劑量組 1021.76±1.10b 27.79±0.63ab 22.49±0.21bc益氣組 1021.80±1.22b 27.02±0.80ab 23.89±0.97ab活血組 1018.90±3.09b 25.93±0.55bc 21.84±0.70bc F 值 115.073453.648347.877 P 值 <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

UC 是一種慢性腸道炎性疾病，患者主要臨床表現包括腹瀉、黏液膿性或血性大便、里急后重、腹痛等，嚴重影響患者生活質量。目前，UC 的確切發病機制尚不完全明確，臨床上尚無根治UC 的藥物［3］，對于活動期UC 患者，臨床治療以提高患者生活質量、誘導維持臨床緩解、促進腸黏膜愈合、預防相關并發癥為主。

優化潰結方是柳越冬教授根據UC 的主要病因病機研制的［7-12］，貫穿健脾、祛濕、益氣、活血的治則，臨床用以治療UC 脾虛濕熱證取得良好療效，已成為治療UC 的經驗方。優化潰結方中敗醬草具有清熱解毒、祛瘀排膿功效，白頭翁具有清熱解毒、涼血止痢功效，共為君藥；黃芪具有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌功效，為臣藥；紅花具有活血通經、去瘀止痛功效，青黛具有清熱解毒、涼血功效，共為佐藥；（炒）白術具有健脾益氣、燥濕利水功效，蒼術具有燥濕健脾、祛風散寒功效，共為使藥；全方藥物配伍，共奏健脾除濕、行氣活血、清熱、止痛之功。

CXCR4 屬于趨化因子受體亞家族，廣泛表達于多種細胞和組織。CXCR4激活后不僅可通過核因子（nuclear factor，NF）-κB 信號通路促進細胞遷移和炎性細胞活化，也可促進JAK/STAT 信號通路的激活并進一步調控免疫細胞的遷移和活化；此外，CXCR4 與基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）結合后還會趨化炎性細胞穿過血管內皮到達炎癥部位。研究表明，UC 患者外周血CD4+T 淋巴細胞CXCR4 表達水平明顯高于健康人，通過SDF-1/CXCR4 信號軸可促進表達CXCR4 的CD4+T 淋巴細胞沿著受損結腸組織中的SDF-1 濃度梯度遷移至損傷部位，進而發揮免疫抑制作用，而CXCR4 的特異性拮抗劑T140 可通過阻斷SDF-1/CXCR4 信號軸減輕葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎模型大鼠的炎性反應，并抑制促炎性細胞因子的產生［6］。VEGFA 是促進血管生成的關鍵因子，也是UC發生發展過程中的重要促炎性細胞因子之一。有研究表明，UC 患者體內活化血小板的α 顆粒釋放血管生成調節蛋白可促進VEGF 的表達，進而加重炎性反應［4］。TAK1 屬于MAP3K 家族，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，是NF-κB 信號通路中的重要調節因子。研究表明，TAK1 激活后不僅可促使NF-κB 核轉位并調節靶基因轉錄，進而引發炎性反應，還可通過激活JAK/STAT 信號通路參與細胞增殖、巨噬細胞激活及炎性反應［5］。上述信號通路之間的交叉調控與相互作用使得VEGFA、TAK1、CXCR4 在UC 的發生、發展中發揮著重要作用，但具體的信號通路交叉機制可能因細胞類型、疾病狀態和微環境不同而有所變化［6，13-15］。

實驗研究表明，優化潰結方能有效降低TNBS/乙醇誘導的UC 大鼠結腸組織促炎性細胞因子白介素1β、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-β1 表達水平，提高結腸組織VEGF 表達水平，進而抑制腸道炎性反應，促進腸道受損黏膜修復與潰瘍愈合［16］。基于已知蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡或分子相互作用數據庫的預測算法表明，優化潰結方中藥物成分主要通過CXCR4、VEGFA、TAK1 等靶蛋白及炎癥、免疫等相關的關鍵信號通路發揮治療作用。本研究結果顯示，柳氮磺胺吡啶組、低劑量組、標準劑量組、益氣組、活血組大鼠干預后結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 蛋白灰度比值及mRNA 相對表達量均低于模型組，活血組大鼠干預后結腸組織VEGFA、TAK1 mRNA 相對表達量低于柳氮磺胺吡啶組，提示優化潰結方及其益氣、活血組分可有效降低UC 氣滯血瘀模型大鼠CXCR4、VEGFA、TAK1 表達水平，分析其作用機制可能如下：黃芪含有黃酮類化合物、多糖類、氨基酸、三萜類化合物等活性成分，不僅可通過抑制VEGFA 而減少結腸組織血管供應，還可通過抑制TAK1 信號通路而減輕結腸組織損傷；紅花含有羥基香豆素、蕓香甙、胡蘿卜素、紅花黃酮等活性成分［17］，對血管生成過程中關鍵信號分子VEGF 和血管細胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達水平具有調節作用［18-19］，可通過下調VEGF 和VCAM-1 表達水平而抑制新生血管形成、氧化應激反應等［20-21］。需要指出的是，由于前期研究已證實標準劑量的優化潰結方即具最佳療效，增加劑量不僅不會明顯提升療效，反而會增加皮膚發紅、皮疹等不良反應發生風險［7-12］，因此本研究不再進一步探討優化潰結方的劑量問題，更多的是關注其藥物組成、配伍及作用機制等，未再設置加倍劑量組等。

細胞超微結構線粒體數目和核糖體脫顆粒變化可以反映細胞活性與活力變化。一般情況下，細胞能量代謝減弱或細胞凋亡會導致線粒體數目減少或結構破壞，而蛋白質合成減緩或停止則會導致核糖體脫顆粒。因此，通過透射電鏡觀察結腸組織線粒體數目和核糖體脫顆粒變化可用以評估和監測腸黏膜損傷情況。此外，細胞超微結構高爾基體的主要功能是對蛋白質進行修飾和分泌，高爾基體囊膜輕度擴張可能是細胞負荷過大或發生某些病理變化的表現，常見于蛋白質分泌增加、感染或缺氧等。本研究結果顯示，造模后第15 天模型組大鼠腸上皮細胞中重度水腫，細胞器豐富、明顯腫脹；微絨毛局部稀疏、紊亂、大量缺失，部分明顯腫脹；細胞間緊密連接及中間連接結構不明顯，未見明顯橋粒結構，細胞間隙明顯增加，腸屏障結構異常，提示UC 氣滯血瘀模型大鼠造模成功；低劑量組、標準劑量組大鼠結腸組織超微結構趨于正常，但存在不同程度的腸屏障結構受損；益氣組大鼠結腸組織超微結構中存在線粒體損傷，但活血組大鼠結腸組織超微結構中未發現線粒體損傷，分析其原因如下：黃芪活性成分黃芪素等可能會誘發線粒體損傷，而紅花活性成分具有抗氧化、抗炎和保護細胞膜等作用，優化潰結方中同時使用黃芪、紅花，在保證療效的前提下減少了對線粒體的損傷，配伍科學、合理，安全性較高。

中醫理論認為，氣血是人體生命活動的基礎。《血證論》陰陽水火氣血論有言：“人之一身，不外陰陽，而陰陽二字，即是水火，水火二字，即是氣血”。《醫林改錯》［21］中有言：“治病之要訣，在明白氣血，無論外感、內傷，要知初病傷人何物，不能傷臟腑，不能傷筋骨，不能傷皮肉，所傷者無非氣血。”在UC 等胃腸疾病治療過程中，中醫重視調暢氣血，常會在具有活血化瘀功效的方劑（如血府逐瘀湯、膈下逐瘀湯）中加用一些補氣行氣之品，如當歸、黃芪、黨參、甘草、白術等，也會在具有益氣功效的方劑中加用一些活血化瘀之品，如桃仁、紅花、乳香、沒藥、蒲黃、五靈脂、麝香、赤芍、丹皮等。腸道免疫是機體免疫系統的重要組成部分，有研究發現黃芪多糖可促進腸道上皮細胞分化和免疫球蛋白A 的生成，進而增強腸道屏障功能，保護腸道黏膜免受有害物質、細菌等的侵襲［22］；此外，黃芪多糖還可以提高小鼠腸道前列腺素E2 含量，進而促進腸道免疫細胞生長和增殖［23］。因此，筆者推測優化潰結方中的益氣組分具有調理脾胃、增強腸道免疫功能及腸道屏障功能等作用，活血組分具有改善腸道黏膜微循環、平調氣血等作用，配伍使用有利于促進UC 患者結腸組織損傷及腸上皮細胞的修復，益氣組分與活血組分具有一定協同增效作用。

綜上所述，優化潰結方及其益氣、活血組分可有效降低UC 氣滯血瘀模型大鼠結腸組織CXCR4、VEGFA、TAK1 表達水平，其治療作用可能是益氣組分、活血組分通過協同調節結腸組織中CXCR4、VEGFA、TAK1 表達水平而實現的。目前優化潰結方的具體化學成分尚未完全明確，需要進一步探索，而隨著近年來對腸道菌群與腸道炎癥、腸道屏障功能關系的研究深入，優化潰結方對腸道菌群的調節作用也是未來研究方向之一，并有可能為深入了解其治療作用及作用機制研究等提供新的思路。

作者貢獻：張帥、李娜提出研究目標，負責研究的構思與設計，數據收集與論文撰寫；沈江立、柳越冬、吳憲樹、王磊、盛天驕負責數據錄入及統計分析；徐紅俊負責文章的審校；張帥、李娜、安勝軍負責文章的質量控制與審校，對文章整體負責。

本文無利益沖突。