腺苷A3受體對淺筋膜成纖維細胞cAMP/Epac信號通路及炎癥因子表達的影響*

崔艷茹， 許經萍， 可紅， 席超， 徐尚呈， 杜紅， 屈飛

（江西中醫藥大學， 江西 南昌 330004）

中醫經絡系統作為針灸治療的理論基礎，具有運行氣血、連接全身臟腑表里的功能，現有醫學技術和解剖學研究并不能完全闡述經絡的實質。筋膜從表到里依次為真皮層、淺筋膜、深筋膜、內臟筋膜[1]，是一個全身連續的網絡，貫穿并包圍所有器官、肌肉、骨骼和神經纖維，被認為是單一的器官，統一的整體，與人類生理學的各個方面都有聯系[2]。白宇等[3]通過發現，經絡的實質是全身非特異性結締組織所構成的筋膜支架，筋膜作為支撐、營養和儲備系統遍布全身，其位置和走形與經絡相似，穴位則為筋膜上能夠被刺激產生生物信息的位置。

淺筋膜分布著大量的穴位，成纖維細胞作為淺筋膜中最主要的細胞，具有較強的增殖能力，參與組織修復的過程，是經絡腧穴主要的感受性細胞和效應性細胞，在針刺力的信號傳導中具有重要意義[4]。

針刺鎮痛主要和調控炎癥有關，cAMP、Epac在炎癥反應中扮演了重要角色[5]。研究發現，針刺可通過降低ERK1/ERK2 下游轉錄因子cAMP 反應元件結合蛋白的DNA 結合活性，減輕炎癥反應和緩解疼痛，治療炎癥性疼痛大鼠[6]。針刺可通過降低cAMP 激活的交換蛋白Epac1 和Piezo2 的表達減輕炎癥后腸易激綜合征的機體的超敏反應[7]。針刺可通過抑制白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和單核細胞趨化蛋白-1 的表達，治療膠原誘導的關節炎大鼠模型[8]。

文獻報道，針刺可引起穴位區腺苷釋放[9]，腺苷可作為一種工具藥，作用于穴位區，起到類似針刺的作用[10]，其作用機制尚不明確。本課題組致力于研究淺筋膜中腺苷A3 受體（adenosine A3 receptor,A3R）途徑在針刺鎮痛中作用機制，前期研究發現A3R 在痛覺傳導通路中的脊髓、腦干、丘腦、大腦皮層均有廣泛表達，在足三里淺筋膜、腹股溝中點處、腹膜淺筋膜亦有分布；針刺足三里淺筋膜可以激活A3R 參與針刺鎮痛，其針刺鎮痛效應可能與上調Ras/MAPK 途徑、下調cAMP/Epac 途徑有關[11-12]。成纖維細胞是淺筋膜中最主要的細胞，本文設計腺苷干預成纖維細胞，觀察成纖維細胞中A3R 表達，以期明確腺苷鎮痛是否與成纖維細胞中A3R 表達有關。前期主要從體內實驗說明A3R 與針刺鎮痛的關系，筆者發現腺苷A3 受體可介導針刺鎮痛，影響cAMP/Epac 信號通路。本研究從體外實驗出發，探討siRNA 轉染淺筋膜中的成纖維細胞通過沉默A3R對cAMP/Epac 信號通路和炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠10 只，體重（200±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2017-0004]。

1.1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000（型號：11668-027）購自美國Invitrogen 公司，Vimentin（貨號：ab92547）、AKA（貨號：ab134923）、CD45（貨 號：ab10558）、cAMP（貨號：ab76238）、Epac（貨號：ab109415）均購自美國Abcam 公司，F Ⅷ（貨號：NB100-91761）購自美國Novusbio 公司，YBR Green PCR 試劑盒（貨號：KM4101）購自美國Novusbio 公司，逆轉錄試劑盒（貨號：639505）購自日本TaKaRa 株式會社，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。IL-6（貨號：AD3249Ra）和TNF-α（貨號：AD3238Ra）購自美國Andygene 公司。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳恒溫培養箱（型號311）購自美國Thermo 公司，熒光倒置顯微鏡（型號IX53）購自日本Olympus 株式會社，離心機（Centrifuge 5424R 型）購自德國Eppend 公司，熒光定量PCR 儀、水平電泳設備（型號DYC-31D）、凝膠成像系統（型號Universal Hood Ⅱ型）和電泳儀（型號mini protean 3 cell）購自美國BIO-RAD 公司，酶標儀（型號MK3）購自芬蘭雷勃公司，全自動化學發光分析儀（型號Tanon-5200）購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠淺筋膜成纖維細胞的原代分離 在無菌的條件下獲取大鼠淺筋膜組織，并去除腹膜上的脂肪組織和血管，將組織切為1 mm×1 mm×1 mm 的小方塊置于DMEM 培養液中，置于37 ℃水浴搖床消化，將收集的細胞以1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用完全培養基（1%三抗+ 10%胎牛血清+ 89%DMEM）重懸細胞，置于37 ℃、5% 二氧化碳細胞培養箱內靜置培養，48 h 換液，每隔2～3 d 換1 次液。待細胞長至85%左右時，開始進行傳代（1∶3 傳代），顯微鏡下觀察細胞狀態。

1.2.2 實驗分組 腺苷預處理細胞并分為Control組、10 nmol/L組、100 nmol/L組、10 μmol/L組和100 μmol/L組，均培養48 h。腺苷siRNA 干擾實驗將細胞分為對照組、腺苷組、A3R 干擾組、空載組。轉染前1 d 將0.5×105～2.0×105個/孔細胞接種于24 孔板，A3R 干擾組添加2 μL siRNA-A3R（20 μmol/L）、空載組添加2 μL siRNA-NC（20 μmol/L）用來轉染，細胞在培養箱孵育6 h 后換上維持液，培養48 h。對照組不予任何處理，腺苷組用10 μmol/L 腺苷濃度，培養48 h。

1.2.3 免疫熒光檢測淺筋膜成纖維細胞Vimentin、CD45、FⅧ、AKA、ICAM-1表達 將細胞用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）洗2 次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，再將細胞置于0.5% Triton X-100 室溫通透20 min，用5%胎牛血清蛋白37℃封閉1 h，封閉完成后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌一抗3次，再加入二抗，37 ℃孵育1 h，用PBS 洗滌3 次，洗去多余的二抗。再加少量抗熒光淬滅封片液[含4′， 6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）]，覆蓋住樣品，置于熒光顯微鏡下觀察，將同一位置的2張熒光圖片重疊為Merge圖。

1.2.4 siRNA轉染 轉染前1天將細胞以0.5×105～2.0×105個/孔密度接種于24孔中，保證轉染時細胞匯合達90%～95%。準備2種復合物，第1種是將0.8 μg DNA稀釋于50 μL Opti-MEM中形成的復合物；第1種將2 μL Lipofectamine 2000 稀釋于50 μL Opti-MEM 形成的復合物，室溫孵育5 min，再將第2種復合物緩慢加入第1種中，繼續室溫孵育20 min，加入培養孔中，置于二氧化碳培養箱中孵育6 h，48 h后檢測細胞轉入基因表達。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測cAMP、Epac mRNA表達 用TRIzol 提取總RNA，再將RNA 逆轉錄為cDNA，逆轉錄樣本置于-20 ℃冰箱冷凍保存，將制備好的cDNA 進行PCR 擴增，反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，56℃退火10 s，72 ℃拉伸25 s，39個循環后65 ℃拉伸5 s，95 ℃再變性50 s。采用2-ΔΔCt法計算cAMP、Epac mRNA相對表達量。見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.6 Western blotting 檢測A3R、cAMP、Epac 蛋白表達 將細胞從培養箱中取出，吸出培養液，用預冷的PBS 洗3 次，加入裂解液，4 ℃充分裂解細胞，將細胞刮入1.5 mL EP 管中，95 ℃以上加熱10 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，制備8%、12%的分離膠，每孔上樣量為10 μg，電泳1.5 h、轉膜50 min、將膜置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入A3R、cAMP、Epac 抗體，一抗4 ℃孵育過夜，再用TBST 洗滌3 次，再將膜置于1∶10 000 稀釋HRP 標記的二抗中，室溫孵育1 h，再用TBST 洗滌3 次，電化學發光法化學顯色，用TANON GIS 軟件分析條帶的灰度值。

1.2.7 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測上清液IL-6、TNF-α水平 將細胞以0.5×105～2.0×105個/孔接種于24孔板，進行siRNA 轉染。在37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養48 h 后，收集上述各孔培養上清液，采用ELISA 檢測上清液IL-6、TNF-α 水平，按照試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定570 nm 波長處吸光度值，計算IL-6、TNF-α 相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 淺筋膜成纖維細胞的分離鑒定

鏡下成纖維細胞呈梭形（見圖1）。Vimentin 為Ⅲ型中間絲蛋白，主要表達于中胚層起源的間充質細胞中，在成纖維細胞中大量分布，可作為成纖維細胞的標志。免疫熒光結果顯示，Vimentin 陽性，FⅧ，CD45、AKA 陰性（見圖2）。

圖1 淺筋膜成纖維細胞

圖2 淺筋膜成纖維細胞Vimentin、CD45、FⅧ、AKA表達 （免疫熒光染色）

2.2 各組A3R蛋白相對表達量比較

Control 組、10 nmol/L 組、100 nmol/L 組、10 μmol/L組和100 μmol/L 組A3R 蛋白相對表達量分別為（0.24±0.01）、（0.29±0.02）、（0.36±0.02）、（0.41±0.02）和（0.45±0.02），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=166.700，P=0.000）；進一步組間兩兩比較，100 μmol/L 組高于其他4 組（P＜0.05），10 μmol/L組高 于Control 組、10 nmol/L 組、100 nmol/L 組（P＜0.05），100 nmol/L 組高于Control 組、10 nmol/L 組（P＜0.05），10 nmol/L 組高于Control 組（P＜0.05），表明腺苷預處理可劑量依賴性地上調A3R 蛋白表達。見圖3。

圖3 各組A3R蛋白條帶圖

對照組、腺苷組、A3R 干擾組、空載組A3R 蛋白相對表達量分別為（0.37±0.05）、（0.65±0.07）、（0.15±0.03）和（0.64±0.05），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=64.270，P=0.000）；進一步組間兩兩比較，腺苷組高于對照組（P＜0.05），A3R 干擾組低于腺苷組（P＜0.05），但空載組與腺苷組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明腺苷siRNA干擾可下調A3R蛋白表達，而空載組并無明顯影響。見圖4。

圖4 各組A3R蛋白條帶圖

2.3 各組cAMP、Epac mRNA相對表達量比較

對照組、A3R 干擾組、空載組cAMP、Epac mRNA相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步組間兩兩比較，A3R 干擾組均高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組cAMP、Epac mRNA相對表達量比較 （±s）

表3 各組cAMP、Epac mRNA相對表達量比較 （±s）

組別cAMP mRNA Epac mRNA對照組A3R干擾組空載組F 值P 值1.00±0.00 2.87±0.04 0.78±0.09 71.810 0.000 1.00±0.00 6.51±0.72 1.03±0.16 165.900 0.000

2.4 各組cAMP、Epac蛋白相對表達量比較

對照組、A3R 干擾組、空載組cAMP、Epac 蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步組間兩兩比較經LSD-t檢驗，A3R 干擾組高于對照組（P＜0.05）。見表4 和圖5。

表4 各組cAMP、Epac蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 各組cAMP、Epac蛋白相對表達量比較 （±s）

組別cAMP蛋白Epac蛋白對照組A3R干擾組空載組F 值P 值0.35±0.04 0.52±0.04 0.32±0.04 24.930 0.001 0.41±0.04 0.57±0.04 0.41±0.03 18.820 0.003

圖5 各組cAMP、Epac蛋白條帶圖

2.5 各組IL-6、TNF-α相對表達量比較

對照組、A3R 干擾組、空載組IL-6、TNF-α 水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；進一步組間兩兩比較經LSD-t檢驗，A3R 干擾組高于對照組（P＜0.05）。見表5 和圖6。

表5 各組IL-6、TNF-α水平比較 （pg/mL， ±s）

表5 各組IL-6、TNF-α水平比較 （pg/mL， ±s）

組別IL-6 TNF-α對照組A3R干擾組空載組F 值P 值39.32±6.61 136.64±13.48 37.40±4.70 117.100 0.000 73.49±1.31 198.66±1.66 98.22±42.97 21.370 0.002

圖6 siRNA干擾A3R表達對ICAM-1表達的影響

3 討論

針刺鎮痛機制具有多樣性，復雜性，矛盾性等特點，大多研究主要是從神經機制主導來闡述，如中樞神經傳導、中樞神經遞質、免疫學炎癥因子參與針刺鎮痛[13-14]。在慢性壓迫性損傷疼痛模型中，電針可以通過增強脊髓中強啡肽的表達，提高脊髓小膠質細胞上κ 阿片受體mRNA 表達，來抑制Toll 樣受體4 的疼痛信號傳導[15]。也有一部分學者認為，筋膜結締組織和局部的生化改變也可介導針刺鎮痛機制。筋膜作為一種膠原纖維結締組織，具有支持和儲備功能，其在形態學和功能學與中醫經絡相似，而且結締組織平面與經絡、穴位和針刺鎮痛機制密切相關[16]，陳德成等[17]提出可以找到肌筋膜激痛點，針刺至皮下淺筋膜處留針，通過主動運動來進行針灸治療。

成纖維細胞作為穴位感受器，能對刺激產生較強的生化信號。針刺作為一種傷害性機械性刺激，通過提插捻轉等手法形成力學信號，引起筋膜結締組織發生形變，作用到對刺激敏感的成纖維細胞，激活細胞，引起細胞發生變異，如突起、周長和橫截面積的改變，通過換能將細胞表面的信號轉化為胞內生化信號途徑，最終將生化信號轉化為針刺效應[4]。陳波等[18]發現在體外實驗中，給予筋膜中成纖維細胞壓力刺激，能使細胞回縮、間隙增大和形態縮小。本課題組前期研究發現，體外壓力刺激可以上調A3R，激活MAPK 信號通路，誘導成纖維細胞腺苷的表達增加，促進成纖維細胞增殖[19]。壓力刺激可能會激發和提高穴位處的筋膜成纖維細胞的活力[20]。由此可見，筋膜中的成纖維細胞可能介導力學傳導，影響針刺效應。本研究結果顯示，腺苷siRNA 干擾可下調A3R 表達，提示筋膜中的成纖維細胞的A3R 可能參與針刺鎮痛的過程。本實驗培養淺筋膜成纖維細胞，應用不同濃度腺苷干預，結果顯示，腺苷可劑量依賴性地上調成纖維細胞A3R 表達，提示腺苷可能通過A3R 發揮作用，那么成纖維細胞A3R 表達增加的意義值得探討。

鐘歡等[21]提出針刺可以治療大鼠慢性萎縮性胃炎，下調COX-2、IL-6、IL-8 水平。鄭倩華等[22]發現在膝骨性關節炎模型中，針刺可以降低IL-6、Chemerin表達，提示針刺可能具有抗炎作用。有研究發現，Epacs 在炎癥的產生增強中起著至關重要的作用[23]。炎癥損傷引起感覺細胞中Epac 表達大幅升高。在炎癥性損傷后，PGE2 通過激活PKA 和Epac-PKC 產生增強的痛覺過敏，cAMP/Epac 可以增強炎癥后PGE2介導的痛覺過敏，對炎癥疼痛有著關鍵作用。在由皮膚肌肉切開牽拉誘導的CPSP 大鼠模型中，鞘內注射Epac1 抑制劑CE3F4 可明顯抑制皮膚肌肉切開牽拉誘導的機械性異常和脊髓中星形膠質細胞的活化，表明脊柱Epac1 介導的星形膠質細胞活化可能有助于緩解慢性術后疼痛，抑制Epac1 可以有效預防CPSP，提示cAMP/Epac 可能參與炎癥的調節[24]。本課題組前期研究發現，A3R 途徑的激活可以下調cAMP/Epac 通路，在針刺前注射A3R 激動劑IBMECA 可進一步下調cAMP、Epac 表達，A3R 拮抗劑Reversine 可逆轉這一效應。本研究結果發現，siRNA干擾下調A3R 表達后，cAMP、Epac 表達上調，與前期實驗結果一致。在前期實驗發現，A3R 途徑激活可能有利于改善炎癥疼痛，本實驗結果發現，siRNA 干擾A3R 表達后，IL-6、TNF-α 表達上調，提示沉默的A3R 途徑可能不利于炎癥疼痛，與上調淺筋膜成纖維細胞的cAMP/Epac 信號通路有關；針刺可能通過調節炎癥來發揮鎮痛效應，這可能與針刺激活A3R，下調cAMP/Epac 通路，降低炎癥因子表達有關。

綜上所述，結合前期的體內實驗和本實驗發現，針刺可能通過激活A3R 途徑，下調cAMP/Epac 通路，降低IL-6、TNF-α 表達，起到抗炎鎮痛作用。