富士和新紅星蘋果虎皮病抗病性與生理生化特性關系比較研究

王燕 王建鋒 謝欣蔚 王穎 惠偉

摘? ?要? ?虎皮病是蘋果長期貯藏過程中的主要生理病害，一般發生在冷藏的中、后期。為比較冷藏過程中富士和新紅星蘋果虎皮病抗病性與生理生化的關系，解析虎皮病發生機制，定期測定富士和新紅星蘋果在冷藏（0±0.5 ℃）期間的硬度、可溶性固形物、乙烯釋放速率、呼吸速率和虎皮病發病率、病情指數，以及果皮α-法尼烯合成酶基因（AFS1）表達量、α-法尼烯、共軛三烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO）和總抗氧化性的變化。結果表明，冷藏過程中，富士的硬度和可溶性固形物含量均高于新紅星，而其呼吸速率和乙烯釋放速率整體低于新紅星；富士冷藏210天出庫時和10天（25 ℃）貨架期后，均無虎皮病發生；新紅星出庫時虎皮病發病率和病情指數分別為73.3%和51.1%，且經過10天貨架期后，分別增至100%和87.8%。冷藏期間富士的AFS1基因表達量、α-法尼烯、共軛三烯和MHO含量均低于新紅星。兩個品種果皮的總酚、類黃酮和花青苷含量在冷藏期間無顯著差異，但富士的DPPH自由基清除率整體高于新紅星。冷藏過程中，與新紅星相比，富士對虎皮病的抗病性表現為較低的果實乙烯釋放速率和果皮α-法尼烯代謝產物含量，以及相對較高的果皮抗氧化能力。

關鍵詞? ?虎皮病；抗氧化性；α-法尼烯代謝；抗病性；蘋果

中國是世界上最大的蘋果生產國和消費國，2021年全國蘋果總產量4 579.34萬t，占世界總產量的54.7%。我國蘋果90%以上用于鮮食，貯藏保鮮在緩解果實賣難，實現季產年銷中起到了重要作用。由于貯藏期長，一些蘋果品種在冷藏中、后期易發生虎皮病，造成嚴重的貯藏損失。虎皮病發病初期，病變部位呈不規則狀淡褐色，面積較小，后隨冷藏時間延長，病斑擴大，嚴重時連接成片。果實出庫后，病斑面積迅速擴大，顏色加深，病果失去商品價值。前人研究表明，虎皮病的發生與品種、采收與處理、貯藏條件等有關。目前有關發病機理的研究主要集中在果實中α-法尼烯及代謝產物和抗氧化能力兩個方面。Mditshwa等發現，果實產生的乙烯誘導α-法尼烯合成，之后它自氧化成共軛三烯（CT）和6-甲基-5-庚烯-2-酮（MHO），誘發虎皮病。α-法尼烯通過甲羥戊酸途徑合成，其中α-法尼烯合成酶（AFS）是α-法尼烯合成過程中關鍵的限速酶，而AFS1是AFS基因家族中與蘋果虎皮病關系較為密切的基因。此外，蘋果虎皮病的發生與果皮中氧化還原狀態密切相關。果實衰老過程中形成的活性氧參與α-法尼烯自氧化過程，降低了膜的完整性，讓處于細胞內不同區域的酚類物質與多酚氧化酶發生酶促反應，形成醌，從而產生褐斑，導致虎皮病。蘋果多酚和類黃酮具有抗氧化作用，通過清除自由基來保護果皮細胞，花色素苷是類黃酮的主要組分，是紅色品種著色的物質基礎，一般著色面具有良好的抗氧化性，虎皮病發病率較低。本文試圖通過比較不同虎皮病發生程度的富士（抗病性強）和新紅星（感病性強）兩個品種在冷藏期間果皮中α-法尼烯代謝以及抗氧化能力等變化，揭示紅色蘋果品種虎皮病發生的可能機理，為培育抗虎皮病蘋果品種提供依據。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料和處理? ?在陜西白水縣采收達到商業成熟度的富士和新紅星蘋果，采后當天選取大小均勻、無機械損傷和病蟲害的果實作為試驗材料，次日裝箱貯藏于冷庫，3天降溫至? ? ?0±0.5 ℃，相對濕度保持90%～95%。冷藏210天后轉移至25 ℃環境中進行貨架貯藏。

1.2? ?測定指標及方法

1）測定硬度與可溶性固形物。每次取10個果實，用FT327型硬度計測硬度，用WYT-J 型手持折光儀測可溶性固形物含量。

2）測定乙烯釋放速率與呼吸速率。參照高俊鳳方法，每個處理從冷庫中取10個果實，在真空干燥器中密封2小時，用注射器抽取1 mL氣體，用安捷倫6890N氣相色譜儀測定乙烯釋放速率（單位μL/kg·h），重復3次。

3）統計虎皮病發病率和病情指數。

4）AFS1基因的表達。采用改良后的CTAB法，提取-80 ℃蘋果果皮凍樣總RNA。使用TaKaRa反轉錄試劑盒對已提純度較好的RNA進行cDNA合成。通過上海生工生物有限公司設計并合成引物，實時定量引物序列為Actin（F：5-ATCGTGGTCATTGGCCATGT-3R：5-AGCCTGTGAGGTTCCAGTAATCAT-3） AFS1（F：5-CACAAGAATGAAGATCTTTTGTΑ-3R：5-CAACAACGTTACAAACTGTAAAG-3）。將已轉錄成cDNA的樣品取出后，參照TaKaRa SYBR Premix ExTaq ll試劑盒說明書進行實時定量PCR分析。

5）測定α-法尼烯、共軛三烯和MHO。參照Anet方法稍作改進，用打孔器打取組織小圓片，隨機取20片，放入50 mL離心管中，加入10 mL純化的正己烷，在25 ℃，60 Hz搖床上震蕩提取2小時，之后過濾定容至10 mL，迅速在232 nm波長下比色，測定α-法尼烯含量。

另取提取液3 mL，于281 nm及290 nm處比色，測定共軛三烯含量。

參照Ju等方法稍作改進，測定MHO含量。使用固相微萃取—氣相色譜法（SPME-GC），用直徑2 cm的打孔器隨機打20個果皮組織圓片（厚度3 mm），加入15 mL樣品瓶中，加2 mL NaCl溶液（200 g/L）密閉3小時。用老化后的萃取頭萃取20分鐘后進行GC分析。進樣口解析2分鐘。GC設置為不分流進樣；柱初溫40 ℃保持2分鐘后，以50 ℃/min的速率升至250 ℃，運行2分鐘；用氫離子火焰（FID）檢測器，溫度250 ℃。用外標法定性，單位μL/kg·h。

6）測定總酚和類黃酮含量。參照陳瑋琦等的方法，采用 Folin-ciocalteu 法測定總酚。取研磨后的果皮凍樣于1%HCL-甲醇溶液中避光浸提24小時，70 ℃超聲波提取60分鐘，9 000 rpm/min離心10 分鐘，取上清液用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法測定果皮類黃酮含量，每個樣品3次重復。

7）測定花青苷相對含量。參照宋哲等的方法測定花青苷含量，稍作改進。取10個樣果，將果皮切碎充分混合，取0.5 g鮮樣，加入20 mL HCL-甲醇溶液，4 ℃下浸提24小時，用分光光度法測定提取液657 nm和530 nm處吸光? ? 度值，兩者吸光度值之差即為花青苷的相對? 含量。

8）測定DPPH自由基清除率。參照陳瑋琦等的方法測定DPPH自由基清除率，稍作改進。向0.5 mL樣品提取液中加入4.5 mL DPPH溶液，搖勻，暗處室溫放置30分鐘，于517 nm處測定吸光度值，每個樣品重復3次。

9）數據處理與作圖。所有處理和測定指標均重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，用Excel 2003軟件進行數據統計、作圖。

2? ?結果與分析

2.1? ?冷藏期間富士和新紅星蘋果硬度、可溶性固形物含量變化? ?由圖1A可知，冷藏期間，富士和新紅星的硬度皆隨冷藏時間延長呈逐漸降低趨勢。除在第120 天時兩種蘋果的硬度達到相同值6 kg/cm2外，在整個冷藏過程中富士的硬度整體高于新紅星，且差異顯著（P ＜0.05）。由圖1B可知，富士在整個冷藏期間的可溶性固形物含量始終高于新紅星，兩者差異極顯著（P ＜0.01）。冷藏7個月時，它們的可溶性固形物含量分別由16.8%、12.4%降到14%、10%。

2.2? ?冷藏期間富士和新紅星蘋果乙烯釋放速率和呼吸速率的變化? ?由圖2A可知，整個冷藏期間，富士在第120天達到乙烯釋放峰值，而新紅星在冷藏第90天即達到乙烯釋放峰值，比富士提前30天，而且峰值極顯著高于富士（P ＜ 0.01）。由圖2B可知，整個冷藏期間，富士和新紅星呼吸速率皆于冷藏第90天達到峰值，富士呼吸速率始終低于新紅星，兩者差異顯著（P ＜0.05）。

2.3? ?冷藏期間富士和新紅星蘋果虎皮病發病率和病情指數的變化? ?由圖3A可知，冷藏結束（210 天）時，富士未發生虎皮病，出庫室溫下（25 ℃）放置10 天后，仍沒有發生虎皮病。冷藏結束（210天）時，新紅星虎皮病果率為73.3%，出庫室溫下放置10天后，新紅星病果率增至100%，相比冷藏期剛結束時，發病率增加26.7%，差異顯著（P ＜0.05）。由圖3B可知，冷藏結束（210 天）時新紅星虎皮病病情指數為51.1%，出庫室溫下放置10天后，病情指數升高到87.8%，相比冷藏期剛結束時增加了36.7%，差異極顯著（P ＜0.01）。

2.4? ?冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮內AFS1基因相對表達量的變化? ?由圖4可知，整個冷藏期間，富士和新紅星果皮內AFS1基因的表達量與乙烯的變化趨勢相似，富士比新紅星推遲1個月，分別在第120天和90天達到峰值，且峰值差異顯著（P ＜0.05）

2.5? ?冷藏期間富士和新紅星蘋果果皮中α-法尼烯、共軛三烯和MHO含量的變化? ?由圖5A可知，整個冷藏期間，富士和新紅星果皮內α-法尼烯含量變化類似AFS1基因表達量變化，富士于150天達到峰值，新紅星于120天達到峰值，富士峰值低于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。由圖5B可知，整個冷藏期間，富士和新紅星果皮內共軛三烯含量皆呈增加趨勢，富士共軛三烯含量始終低于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。由圖5C可知，冷藏90天后新 紅星果皮內MHO含量呈快速增加趨勢，而富士果皮中MHO的含量保持相對穩定水平，且冷藏第120天后均低于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。

2.6? ?冷藏期間富士和新紅星蘋果抗氧化能力的變化? ?由圖6A可知，整個冷藏期間，富士果皮內類黃酮含量波動較大，在150天時出現峰值達到0.34 mg/g，而新紅星果皮內類黃酮含量較富士變化平穩，二者差異不顯著（P? ＞0.05）。

由圖6B可知，整個冷藏期間，兩個品種果實花青苷含量都呈現先短暫升高后降低的變化趨勢。在冷藏初期（0～60天），富士花青苷含量變化不明顯，第90天前有過短暫增加，此后開始降低；果皮內花青苷含量0～60天時較高，峰值出現在冷藏第60天，此后開始降低。冷藏120天后，富士和新紅星果皮內花青苷含量差異不顯著（P? ＞0.05）。

如圖6C所示，整個冷藏期間，富士和新紅星果皮內總酚含量皆呈現先升高后降低的變化趨勢，富士于冷藏120天達到峰值（6.98 mg/g），新紅星于150天達到峰值（6.6 mg/g），整個冷藏期間富士果皮內總酚含量整體高于新紅星，二者差異顯著（P ＜0.05）。

自由基清除能力是蘋果總抗氧化能力的一個指標，由圖6D可知，整個冷藏期間，兩個品種果皮內DPPH自由基清除能力都呈現逐漸降低趨勢，但富士的下降速度相對緩慢。在冷藏初期（30天），兩個品種DPPH自由基清除能力差異不顯著（P? ＞0.05），30天后，富士DPPH自由基清除能力始終高于新紅星，二者差異顯著（P? ＜0.05）。由此說明，冷藏期間富士果皮抗氧化能力高于新紅星。

3? ?討論

虎皮病是一種生理性病害，不影響果肉顏色，但會造成果實風味下降，失去商品價值。富士和新紅星都是紅色蘋果品種，新紅星冷藏4個月就開始發生虎皮病，富士發病期在冷藏7個月以后，程度較輕。

Ding等研究發現，青香蕉蘋果冷藏90天虎皮病隨乙烯釋放速率上升而加重。本研究發現，冷藏過程中新紅星乙烯釋放速率、呼吸速率整體高于富士（圖2）；兩個品種冷藏后期虎皮病發病差異極顯著（P ＜0.01），富士始終未發病而新紅星發病率極高（圖3A），這與品種耐貯性差異有關，新紅星果肉容易發綿，而富士則能夠一直保持較高的硬度（圖1A）。

有關蘋果虎皮病發病機理的研究表明，α-法尼烯及代謝產物誘導了虎皮病的發生。蘋果冷藏期間產生大量α-法尼烯，之后極易被氧化生成共軛三烯，共軛三烯又氧化成MHO，這些揮發性物質是誘導虎皮病發生的關鍵。索江濤等認為，α-法尼烯和共軛三烯的積累與紅富士蘋果虎皮病的發生有顯著正相關性。Sabban等證實了澳洲青蘋虎皮病的發生與其內源MHO含量有關。Farneti等對澳洲青蘋果皮中非靶向代謝物進行研究，共發現3種代謝產物，其中MHO與虎皮病關系極為密切。蘋果的α-法尼烯合成酶基因AFS1對α-法尼烯合成起著至關重要的作用，而且AFS1基因受到乙烯調控，感病品種的AFS1基因表達水平更高。本試驗研究發現，雖然冷藏過程中兩個品種果皮的α-法尼烯含量呈現先升高后降低趨勢（圖5A），但富士AFS1基因表達量和α-法尼烯含量的峰值都比新紅星推遲1個月；新紅星果皮共軛三烯和MHO含量在冷藏過程中均保持上升趨勢，而富士共軛三烯和MHO含量一直低于新紅星（圖5），這可能與富士蘋果較強的抗病性能有關。

虎皮病的發生與果實抗氧化能力有關，富士和新紅星都是紅色果皮品種，且果皮中都富含類黃酮等多酚類物質，它們對虎皮病的抗病性差異是否與這些物質含量有關，目前未見報道。伴隨α-法尼烯大量氧化，細胞膜透性增大，果皮細胞膜系統的完整性及多酚氧化酶（PPO）與底物的區域分布遭到破壞，最終導致虎皮病發生。索江濤等研究發現，1-MCP處理顯著抑制了紅富士蘋果乙烯形成，并降低了多酚氧化酶（PPO）活性，進而保持了多酚等抗氧化物質的含量，最終降低了蘋果虎皮病發病率。蘋果富含多酚類物質，其中黃酮類和花青素類物質是其重要組成，具有較強的抗氧化、抗脂質過氧化活性，并能延緩果實衰老褐變。本研究發現，整體上富士和新紅星的類黃酮含量沒有顯著差異（圖6A）；富士前期花青苷比新紅星還要低一些（圖6B），可能與新紅星乙烯和呼吸高峰更早出現有關。宋哲等人發現，伴隨著蘋果果實的衰老，花青苷迅速降解；楊小幸等研究發現，DPPH自由基清除能力減弱? ?可能是酚類物質減少的重要原因。所以，本研究中富士DPPH自由基清除能力高于新紅星（圖6D）。富士蘋果的抗病性與它總的抗氧化能力高有關。

4? ?結論

新紅星蘋果的感病性與其乙烯釋放速率高有關。富士對虎皮病的抗性與其低乙烯釋放速率和低α-法尼烯及代謝產物含量有關，尤其是共軛三烯、MHO一直維持低水平，并且在冷藏過程中保持了較高的抗氧化能力。

針對不同蘋果品種的果實虎皮病與乙烯釋放速率、抗氧化能力和α-法尼烯及代謝產物的相關性，仍需進一步研究。

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