還原型谷胱甘肽對DR大鼠細胞凋亡、氧化應激及Akt蛋白的作用及機制

楊馥宇 蘇杰 王玲 王林洪 郭明義 雷雨馨

(華北理工大學附屬醫院,河北 唐山 063000)

糖尿病視網膜病變(DR)作為糖尿病最為常見的并發癥之一,現階段已成為大多數患者致盲的首要原因〔1〕。隨著糖代謝發生紊亂,引起視網膜微血管系統損傷,最終引起血管周圍組織細胞凋亡、血管舒縮調節功能異常等病理改變〔2〕。有研究表示,DR的發生發展與體內自由基產生增加及抗氧化能力減弱有關,同時伴隨機體內血液濃度水平升高,蛋白激酶B(Akt)表達降低,并出現視網膜組織細胞凋亡現象〔3〕。還原型谷胱甘肽(GSH)作為天然的抗氧化劑也越來越引起人們的重視,在對于參與治療DR的研究方面也成為當前臨床醫學的討論熱點話題之一〔4〕。GSH作為人體細胞中自然合成的一種肽,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成,廣泛存在于人體各種組織細胞中,具有調節機體中蛋白質和核苷酸合成的作用,對于減少細胞內脂肪蓄積,抑制Akt蛋白和增強機體中抗氧化能力有一定作用〔5〕。本文主要探究GSH對DR大鼠細胞凋亡、氧化應激及Akt蛋白的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取雌雄各半的健康級大鼠40只,4～6個月齡,體質量180～250 g,由基爾頓生物科技(上海)提供,嚴格按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗,動物許可證號:SYXK(上):2019-0045,室溫控制在15～18 ℃室內飼養,濕度約為70%,每日12 h光照,喂養條件為自由攝取標準飼料,飲用干凈自來水。

1.2儀器 FEITecnai G12型透射電鏡(荷蘭);HMIAS 2000型全自動醫學彩色圖像分析系統(美國Sigma公司),One-touch血糖儀(美國強生公司),顯微鏡(重慶光學儀器廠產XSZ-5B),切片機(上海醫用儀器廠),尿糖試紙(桂林中輝科技發展有限公司),一次性無菌注射器(美國BD公司)。

1.3試劑 0.9%生理鹽水(重慶天圣制藥有限公司),GSH(重慶藥友制藥有限公司),檸檬酸緩沖液,細胞凋亡試劑盒(上海生物工程有限公司),GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所),鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司),血清檢測試劑盒(上海滬峰化工有限公司)。

1.4DR大鼠模型建立 大鼠經裂隙燈及眼底檢查均無眼部疾病,并進行適應性喂養1 w后,用隨機數字法分為正常組、模型組、GSH組、Akt抑制劑組,每組10只。除正常組外,其余組大鼠禁食12 h后,50 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素,72 h后采取尾靜脈血,測空腹血糖≥16.5 mmol/L,確定為糖尿病大鼠。分籠飼養4個月后監測尾靜脈血糖>16.7 mmol/L的大鼠采用鹽酸氯胺酮(40 mg/kg)進行腹腔注射麻醉,托品卡安雙眼散瞳,鹽酸丙美卡因眼表面麻醉后進行眼前照相,并經尾靜脈注射0.2 ml濃度為50 mg/ml的異硫氰酸葡聚糖熒光素,眼底血管造影檢查眼底情況,同時具備4個月持續血糖>16.7 mmol/L且眼底血管造影出現微血管瘤及滲漏的大鼠為DR大鼠建模成功。

1.5分組給藥 正常組及模型組腹腔內注射0.1 mmol/L的檸檬酸緩沖液,GSH組每天以100 mg/kg的劑量腹腔注射GSH,Akt抑制劑組使用氯胺酮(40 mg/kg)腹腔麻醉后,經托品卡安散瞳、鹽酸丙美卡因眼表面麻醉、15%磺胺醋酰鈉眼液結膜囊沖洗等處理后,裂隙燈下對Akt抑制劑組用5 μl微量進樣器于顳上方2點位處角膜緣后2 mm睫狀環處進針,行玻璃體腔內注射10 mg/ml Akt抑制劑(MK-2206) 15 μl,深1.0～1.5 mm,注意不要傷及周邊視網膜。大鼠自由攝食后至于相同環境飼養2 d后重復以上步驟處理一次。術后觀察并排除晶狀體及玻璃體損傷大鼠。

1.6氧化應激指標檢測 眼眶靜脈血1 ml,速離心機運轉4 000 r/min,10 min后取得上清液,分別采用硫代巴比妥酸法、二硫代二硝基苯甲酸法檢測各組大鼠視網膜中丙二醛(MDA)、GSH水平,嚴格按照試劑盒說明進行檢測。

1.7血清總膽固醇(TC)、血糖、三酰甘油(TG)檢測 大鼠禁食14～16 h,抽取尾部靜脈血1 ml,5 ℃測空腹血糖,3 500 r/min離心10 min,上清液1 ml裝于1.5 ml EP管中,-20 ℃冰箱保存待測。血糖檢測采用葡萄糖氧化酶法檢測,TC、TG采用酶聯免疫吸附試驗檢測,嚴格按照說明書標準進行測定。

1.8組織提取 各組大鼠使用氯胺酮(40 mg/kg)腹腔麻醉,行眼球摘除,完整摘下眼球于上方12點位角鞏膜緣縫線標記,至于4%多聚甲醛溶液中,置于4 ℃冰箱繼續固定24 h。將視網膜組織分為兩部分,一部分直接凍存-80 ℃冰箱,另一部分石蠟包埋處理并制作5 μm厚度切片。

1.9視網膜病理組織蘇木素-伊紅(HE)染色 將石蠟切片烤片,二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫二甲苯并復水,依照試劑盒步驟進行染色,經梯度乙醇脫水和二甲苯透明后,用中性樹膠封片。光學顯微鏡下對HE染色切片觀察并采集圖片,使用Image-Pro6.0軟件分析視病理形態。

1.10原位末端標記法(TUNEL)染色視網膜細胞凋亡 將包埋好的組織用冰凍機連續切片后,冰凍切片室溫復溫30 min,使用冰丙酮固定8 min,4 ℃磷酸鹽緩沖液(PBS)進行沖洗3次,每次5 min,3%BSA室溫封閉30 min,滴加TUNEL反應混合液室溫孵育1 h,4 ℃PBS沖洗3次,每次5 min,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染1 min,4 ℃PBS沖洗3次,每次5 min,進行封片,顯微鏡下觀察視網膜細胞凋亡率。

1.11Western印跡檢測 取視網膜組織50 mg,加入0.125%胰蛋白裂解液,高速離心機運轉4 000 r/min,10 min后取得上清液,血清樣品中加入樣孔。進行電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)膜緩沖鹽水(TBS)浸泡10 min,反復PBS沖洗,5 min/次,分別加入磷酸化(p-AKT)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸甘油醛3-脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶500)、以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G作為二抗(1∶2 000),分別雜交,PBS沖洗,后將膜浸入電化學發光(ECL)工作液,檢測獲取圖像。

1.12統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組視網膜氧化應激指標比較 與正常組比較,模型組、GSH組、Akt抑制劑組MDA水平升高,GSH水平降低,差異顯著(P<0.05);與模型組比較,GSH組、Akt抑制劑組MDA指標顯著降低,GSH水平顯著升高(P<0.05);GSH組與Akt抑制劑組比較上述指標無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.2各組血糖、血清TC、TG水平比較 與正常組比較,模型組、GSH組、Akt抑制劑組血糖、TC、TG水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,GSH組、Akt抑制劑組上述指標降低,兩組比較有統計學意義(P<0.05);GSH組與Akt抑制劑組比較上述指標比較無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.3各組眼部視網膜組織細胞凋亡指數比較 與正常組比較,模型組、GSH組、Akt抑制劑組視網膜組織細胞凋亡指數升高,差異顯著(P<0.05);與模型組比較,GSH組、Akt抑制劑組上述指標顯著降低(P<0.05);GSH組與Akt抑制劑組視網膜組織細胞凋亡指數比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1、圖1。

2.4各組視網膜Akt、PI3K蛋白表達比較 與正常組比較,模型組、GSH組、Akt抑制劑組視網膜Akt、PI3K蛋白顯著升高(P<0.05);與模型組比較,GSH組、Akt抑制劑組上述指標顯著降低(P<0.05);GSH組與Akt抑制劑組上述指標比較無統計學意義(P>0.05),見表1、圖2。

表1 各組氧化應激指標、血糖、TC和TG水平、眼部視網膜細胞凋亡指數、Akt及PI3k蛋白表達比較

圖1 各組視網膜細胞(TUNEL染色,×200)

2.5各組視網膜HE染色比較 正常組視網膜內、外核層細胞排列緊密、規律,表面光滑平整;模型組視網膜內界出現明顯水腫,內外核層細胞排列不整齊,可見較多的血管內皮細胞突出內界膜;GSH組視網膜內界水腫明顯減輕,且血管內皮細胞突出內界膜情況有所好轉,內核層細胞排列疏松,血管異常情況改善。Akt抑制劑組與GSH組相似,見圖3。

圖2 各組Akt、PI3K蛋白表達

圖3 各組視網膜(HE染色,×400)

3 討 論

DR前期病理改變為視網膜毛細血管周圍細胞減少、基底膜增厚及視網膜屏障破壞并伴隨水腫等,后期由于視網膜內血管內皮生長因子的分泌增多,引起纖維組織和新生血管加厚,最終導致眼部玻璃體組織出血或視網膜脫離等〔6〕。GSH作為一種抗氧化劑也是機體內重要的還原劑,存在于人體各種組織和細胞中,具有調節體內蛋白質和核苷酸合成的作用,并與機體中的抗氧化能力有關〔7〕。氧化應激反應增強是導致糖尿病并發癥形成和發展的重要環節,高血糖狀態時由于機體的抗氧化能力失衡,炎癥因子過度表達,進而導致視網膜屏障破壞發生氧化應激損傷〔8〕。本文提示,GSH對于氧化應激水平的調控有一定影響。有研究證實,糖尿病視網膜中氧化應激增強伴著GSH水平下降,兩者呈負相關〔9〕。GSH對于糖尿病中脂質氧化損傷的程度起到保護作用,能夠有效清除機體內的超氧離子及其他自由基,有效參與葡萄糖誘導的胰島素分泌,進而下調丙二醛(MAD)水平〔10〕。陸孟婷等〔11〕研究表示,GSH能夠在糖尿病中持續活化抗氧化物質使其表達上調,進一步抑制氧化因子產生,同時防止MDA的分泌增加,以減輕視網膜炎性介質的損傷從而延緩DR發展。糖尿病的產生伴隨著機體內部血糖、血清等指標的升高,在對于糖尿病及并發癥的治療中,對于血糖等因素的控制也至關重要〔12〕。本文表明,GSH對于DR大鼠的血糖、TC、TG等指標具有一定抑制作用。GSH通過降低血糖、血清水平,降低體內自由基,提高血清內脂蛋白酯酶和肝酯酶的活性,并通過參與調節自由基的過氧化氫酶、超氧化物等物質的活性來降低糖尿病患者體內的糖基化反應〔13〕。GSH通過阻斷氧化和過氧化的反應來保護生物膜,降低DR患者血糖的活性表達,進而抑制視網膜神經組織紊亂而引發的視網膜功能異常情況〔10〕。

本文結果表明,GSH能夠有效減輕DR大鼠的內膜水腫情況,改善細胞分布紊亂及內皮細胞突出問題。GSH對于保護人體由于高血糖引起的內皮細胞復制延遲,抑制細胞凋亡、促進細胞轉化及維持細胞膜的完整性,參與細胞的有絲分裂、血管的生成及細胞耐性具有重要作用〔14〕。GSH對有多種生化功能,能夠與多種化學物質及其代謝產物結合,以保護視網膜細胞膜的完整性,使內皮細胞免受其害,從而維持視網膜細胞的正常代謝功能〔15〕。

已有研究表明,細胞凋亡作為引起DR發生的核心機制之一,與DR有著密切的聯系〔16〕。本文結果表明,采用GSH干預治療,對于DR大鼠的細胞凋亡具有一定的抑制作用。GSH通過維持DR大鼠的視網膜屏障調節FasL-Fas介導內皮細胞凋亡因素,加速細胞周期的進行,促進細胞的增生,進而減少內皮細胞的損傷和凋亡〔17〕。有研究表示,由于細胞內葡萄糖含量增加可使糖胺合成,進而導致組織內胰島素的抵抗,在高糖環境下導致部分神經細胞喪失,GSH可使毛細血管內皮細胞的反應性氧化物生成增多,并抑制內皮細胞的DNA合成,降低了DR早期出現的神經細胞變性、凋亡〔18〕。因此,GSH對于抑制DR中的眼部毛細血管內皮組織細胞凋亡有一定作用。本文結果與上述研究相似。

DR患者體內的蛋白濃度有明顯增高現象〔19〕。本文結果表明GSH對于抑制DR大鼠的蛋白水平具有一定作用。GSH能夠有效避免Akt/PI3K分子及酶分子中的有效成分發生氧化,并抑制其與有毒化合物結合,防止毒性化合物對蛋白造成的損傷,進而控制組織內炎性因子和抑制Akt/PI3K的表達。Tang等〔20〕研究表示,GSH通過增強糖尿病視網膜組織中血紅蛋白非酶促糖基化作用的抑制強度,降低凝血因子與葡萄糖的結合,進而抑制Akt/PI3K蛋白質糖基化作用,降低視網膜組織內纖維Akt/PI3K的形成,起到穩定Akt/PI3K水平的作用。

綜上所述,GSH作為抗糖尿病藥物,對改善糖尿病的氧化應激和抗脂質氧化,在保護細胞膜的完整性,降低視網膜組織細胞損傷程度和蛋白表達方面具有一定作用。還可以通過抑制細胞凋亡和降低血糖濃度等指標,使內皮細胞免受其害,從而維持細胞的正常代謝以達到對視網膜的保護,為DR的發病機制及治療方法的選擇等提供了新的方向。