miR-29a靶向調節GSK-3β/Nrf2信號通路對膿毒癥大鼠腎組織氧化應激反應的影響

李莉 白瑩 孫穎穎 胡羅文 魏慶慶 嚴宇鵬 王冀

(應急總醫院重癥醫學科,北京 100028)

膿毒癥是重癥監護室(ICU)最常見的危急重癥,患者全身呈現劇烈的炎癥反應,可危及心、肺、腎等多種臟器,其中急性腎損傷是極易發生的嚴重并發癥,腎功能于數天甚至數小時內急速下降是其突出臨床表現,可極大增加患者住院時間與死亡率〔1,2〕。腎臟微循環異常引發的腎組織缺血缺氧及活性氧(ROS)自由基產生過量,從而啟動氧化應激及炎癥級聯反應是膿毒癥誘導急性腎損傷的主要病理機制,故抑制氧化應激是防治膿毒癥腎損傷的有效方式〔3,4〕。miR-29a是調控炎癥與氧化應激的重要微小RNA,介導膿毒癥、缺氧性肺動脈高壓等多種疾病發生發展過程,上調miR-29a-5p可激活核因子E2相關因子(Nrf)2信號,減輕缺氧誘導的人肺動脈內皮原代細胞氧化應激損傷,并通過抑制炎癥緩解脂多糖誘導的急性心肌損傷〔5,6〕。研究顯示,miR-29a表達水平在膿毒癥大鼠體內顯著降低,過表達miR-29a可顯著降低腎組織凋亡蛋白表達,改善膿毒癥引發的腎損傷〔7〕。糖原合成酶激酶(GSK)-3β是miR-29a的下游作用靶點,miR-29a可下調GSK-3β的表達,從而減輕非酒精性脂肪性肝炎癥狀〔8〕。且GSK-3β可參與介導膿毒癥發病過程,降低GSK-3β表達水平能減輕膿毒癥大鼠心肌炎癥損傷,并可通過促進Nrf2信號激活抑制內毒素血癥小鼠炎癥〔9,10〕。但miR-29a是否可通過靶向調節GSK-3β/Nrf2信號減輕膿毒癥大鼠腎組織氧化應激反應,目前尚未有明確報道。本研究探討miR-29a靶向調節GSK-3β/Nrf2信號通路對膿毒癥大鼠腎組織氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性Wistar大鼠購自中國科學院昆明動物研究所〔SCXK(滇)K2020-0002〕,SPF級,體質量210～230 g,在應急總醫院屏障環境動物房中適應喂養,具體操作嚴格遵循中華人民共和國實驗動物管理條例》,動物房內溫度約25 ℃,相對濕度約60%。

1.2主要試劑及儀器 脂多糖〔貨號L2630,Sigma公司(美國)〕;miR-29a agomir、GSK-3β過表達質粒、miR-29a agomir陰性對照、空載質粒、GSK-3β、Nrf2及β-actin引物、一步法反轉錄熒光定量試劑盒(貨號B639277-0100)、胰蛋白酶〔貨號A600626-0005,上海生工生物工程股份有限公司(中國)〕;人腎皮質近曲小管上皮細胞(HK-2,貨號CL-0109)、特級胎牛血清(貨號164210-500)、MEM培養基(貨號PM150410)、青鏈霉素混合液〔貨號PB180120,武漢普諾賽生命科技有限公司(中國)〕;大鼠白細胞介素(IL)-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號SEKR-0007)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒〔貨號D0010,北京索萊寶科技有限公司(中國)〕;ROS測定試劑盒(貨號E004-1-1)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(貨號A001-3-2)、IL-1β測試盒〔貨號H002,南京建成生物工程研究所有限公司(中國)〕;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號C0105)、過氧化氫酶(CAT)活性測定試劑盒(貨號S0051)、丙二醛(MDA)試劑盒〔貨號S0131S,上海碧云天生物技術有限公司(中國)〕;Trizol試劑(批號AHF1813A)、Opti-MEM培養基(貨號31985-070)、LipofectamineTM2000〔貨號11668019,Invitrogen公司(美國)等〕。AU5800全自動生化分析儀〔Beckman Coulter公司(美國)〕;Infinite M200 Pro多功能酶標儀〔Tecan公司(瑞士)〕;DMIL/DFC295倒置顯微鏡、CM1950冰凍切片機〔Leica公司(德國)〕;StepOnePlus Real-Time PCR System實時熒光定量PCR儀、ND-2000C超微量核酸分析儀、PICO17微量高速離心機〔Thermo Fisher Scientific公司(美國)〕等。

1.3建立膿毒癥大鼠模型及分組給藥 將脂多糖加入生理鹽水中溶解混勻,向大鼠腹腔內注射5 mg/kg〔11〕劑量的脂多糖溶液,制備膿毒癥模型,24 h后檢測尾靜脈血中血清肌酐(Scr)、血尿酸(SUA)和血尿素氮(BUN)水平,相比對照組的正常大鼠明顯升高,表明模型建立成功,隨機分為模型組、miR-29a agomir組、GSK-3β過表達組、miR-29a agomir+GSK-3β過表達組、miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組,每組12只,另取12只Wistar大鼠腹腔注射5 mg/kg的生理鹽水,為對照組。將miR-29a agomir、miR-29a agomir陰性對照、GSK-3β過表達質粒、空載質粒溶于生理鹽水,劑量參照說明書,每周尾靜脈注射2次,模型組和對照組以同樣方法尾靜脈注射同劑量的生理鹽水,共注射2 w。

1.4檢測大鼠腎組織病理形態變化及采集標本 2 w的給藥結束后24 h,以乙烷氣體麻醉大鼠后開腹,采集腹主動脈血后以3 000 r/min離心力離心(4 ℃,12 min),小心吸出上清后分組標記,并保存在-80 ℃;取出大鼠腎臟,使用手術剪取下左腎組織約0.5 g,分組標記后保存在液氮中;然后以同樣方法再次取下左腎組織約0.5 g,加入生理鹽水后剪碎、勻漿,以3 000 r/min離心力離心(4 ℃,25 min),小心吸出上清后分組標記,并保存在-80 ℃;使用手術剪取下大鼠右腎,經洗滌、包埋、冰凍、切片后復溫,以冷丙酮固定、過氧化氫溶液孵育、HE染色后于光學顯微鏡下觀察腎組織病理形態。

1.5檢測大鼠血清Scr、SUA、BUN、IL-1β、IL-17及腎組織ROS、MDA、CAT、SOD水平 提前取出1.4中血清,以冰水浴解凍后取500 μl,置于全自動生化分析儀中測出大鼠Scr、SUA、BUN,以ELISA試劑盒測定出血清炎性因子IL-1β、IL-17水平及腎組織ROS、MDA、CAT、SOD水平,具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.6大鼠腎組織GSK-3β與Nrf2 mRNA水平檢測 取出1.4中凍存在液氮中的腎組織,置于適量Trizol試劑中研碎,參照試劑說明指導提取總RNA,使用試劑盒通過一步法進行反轉錄熒光定量實驗,具體步驟及反應條件設置參照說明書指導進行,內參基因選用β-actin,以算法2-ΔΔCt分析得出GSK-3β與Nrf2 mRNA的相對表達水平,各基因引物序列:GSK-3β:正義鏈5′-CACCTGCCCTCTTCAACTT-3′、反義鏈5′-ATTGGTCTGTCCACGGTCT-3′,Nrf2:正義鏈5′-CACATCCAGACAGACACCAGT-3′、反義鏈5′-CTACAAATGGGAATGTCTCTGC-3′,β-actin正義鏈5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′、反義鏈5′-GGG-GTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

1.7檢測miR-29a對GSK-3β的靶向調控作用 快速解凍復蘇HK-2細胞,進行無菌培養(MEM培養基+10%特級胎牛血清+1%青鏈霉素混合液),傳代后于24孔板接種,繼續培養24 h后將其隨機分為6組:GSK-3β 3′-UTR無義序列+miR-29a mimics陰性對照組、GSK-3β 3′-UTR無義序列+miR-29a mimics組、野生型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics陰性對照組、野生型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics組、突變型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics陰性對照組、突變型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics組,將各組細胞以Opti-MEM培養基培養,同時采用LipofectamineTM2000參照其說明指導轉染,6 h后使用含10%特級胎牛血清的MEM培養基繼續無菌培養,24 h后收集各組細胞,使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組相對雙熒光素酶活性,具體步驟參照說明書指導進行。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、方差分析,組間兩兩比較進行LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-29a對大鼠腎功能的影響 與對照組相比,模型組、miR-29a ayomir+GSK-3β過表達組、miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組Scr、SUA和BUN水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-29a agomir+GSK-3β過表達組分別相比,miR-29a agomir組Scr、SUA和BUN水平均明顯降低(均P<0.05);GSK-3β過表達組Scr、SUA和BUN水平均明顯升高(P<0.05);miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組Scr、SUA和BUN水平均無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2miR-29a對大鼠腎組織病理形態的影響 對照組腎組織形態無異常變化,未出現病理損傷。模型組腎臟組織出現嚴重的病理損傷變化,具體表現為:部分腎小管細胞腫脹壞死并發生空泡樣改變,大量炎癥細胞浸潤腎間質,腎小球萎縮變形等。miR-29a agomir組腎組織上述病理損傷改變得到緩解,GSK-3β過表達組腎組織上述病理損傷改變進一步加重,miR-29a agomir+GSK-3β過表達組與miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組腎組織病理損傷變化與模型組相似。見圖1。

表1 各組腎功能指標、血清炎性因子IL-1β、IL-17水平比較

圖1 各組腎組織病理形態(HE染色,×200)

2.3miR-29a對大鼠血清炎性因子IL-1β、IL-17水平的影響 與對照組相比,模型組、miR-29a ayomir+GSK-3β過表達組、miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組血清炎性因子IL-1β、IL-17水平顯著升高(P<0.05)。與模型組、miR-29a agomir+GSK-3β過表達組分別相比,miR-29a agomir組血清炎性因子IL-1β、IL-17水平均明顯降低(P<0.05);GSK-3β過表達組血清炎性因子IL-1β、IL-17水平均明顯升高(P<0.05);miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組血清炎性因子IL-1β、IL-17水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.4miR-29a對大鼠腎組織氧化應激因子ROS、MDA、CAT、SOD水平的影響 與對照組相比,模型組、miR-29a ayomir+GSK-3β過表達組、miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組腎組織ROS、MDA水平顯著升高,CAT、SOD水平顯著降低(P<0.05)。與模型組、miR-29a agomir+GSK-3β過表達組分別相比,miR-29a agomir組腎組織ROS、MDA水平均明顯降低,CAT、SOD水平均明顯升高(P<0.05);GSK-3β過表達組腎組織ROS、MDA水平均明顯升高,CAT、SOD水平均明顯降低(P<0.05);miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組腎組織氧化應激因子ROS、MDA、CAT、SOD水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.5miR-29a對大鼠腎組織GSK-3β與Nrf2 mRNA水平的影響 與對照組相比,模型組、miR-29a ayomir+GSK-3β過表達組、miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組、腎組織GSK-3β mRNA水平顯著升高,Nrf2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。與模型組、miR-29a agomir+GSK-3β過表達組分別相比,miR-29a agomir組腎組織GSK-3β mRNA水平均明顯降低,Nrf2 mRNA水平均明顯升高(P<0.05);GSK-3β過表達組腎組織GSK-3β mRNA水平均明顯升高,Nrf2 mRNA水平均明顯降低(P<0.05);miR-29a agomir陰性對照+空載質粒組腎組織GSK-3β與Nrf2 mRNA水平均無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組腎組織氧化應激因子ROS、MDA、CAT、SOD水平、GSK-3β、Nrf2 mRNA表達比較

2.6miR-29a對GSK-3β的靶向調節 經TargetScan Release7.2的生物信息學預測miR-29a和GSK-3β之間有結合位點,推測GSK-3β可能是miR-29a的靶基因。與轉染GSK-3β 3′-UTR無義序列+miR-29a mimics陰性對照組(0.96±0.20)比較,轉染GSK-3β 3′-UTR無義序列+miR-29a mimics組相對熒光素酶活性無明顯差異(1.00±0.23,P>0.05);與轉染突變型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics陰性對照組(0.98±0.21)比較,轉染突變型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics組相對熒光素酶活性無明顯差異(1.03±0.26,P>0.05);與轉染野生型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics陰性對照組(1.02±0.19)比較,轉染野生型GSK-3β 3′-UTR報告質粒+miR-29a mimics組相對熒光素酶活性顯著降低(0.33±0.07,P<0.05)。見圖2。

圖2 TargetScan Release7.2的生物信息學預測miR-29a和GSK-3β之間的結合位點

3 討 論

膿毒癥引發的急性腎損傷作為ICU患者常見的危重并發癥,病情進展迅速且發病率很高,不僅極大增加患者的治療費用,還明顯增大其死亡風險,是造成ICU患者不良預后的主要原因〔12,13〕。

膿毒癥一般由嚴重感染引起的急性全身強烈炎癥造成,在此過程中,高水平的氧化應激導致的腎組織過氧化損傷是腎衰竭的主要發病機制〔12,13〕。其中,miR-29a與氧化應激和炎性級聯反應密切相關,過表達miR-29a可顯著降低ROS水平,減輕組織脂毒性、過氧化損傷,對其發揮保護作用,并改善細胞增殖障礙及其過早衰老〔15,16〕。miR-29a還參與介導膿毒癥腎損傷、慢性腎病等疾病發病及病情進展過程,上調miR-29a-5p可抑制腎細胞凋亡,緩解腎損傷〔7,17〕。本文與以前研究〔7〕結果相似,進一步證明了miR-29a可通過降低氧化應激水平防治膿毒癥引發的腎損傷。

GSK-3β/Nrf2信號是miR-29a的一個下游調控靶點,miR-29a可通過調控介導Gsk-3β/Nrf2信號的傳導而參與過氧化及炎癥疾病的發生及進展〔8,18〕。另有研究顯示,激活GSK-3β/Nrf2信號可通過降低炎癥和氧化應激水平,減輕脂多糖誘導的大鼠急性腎損傷〔19〕。但促進GSK-3β/Nrf2信號傳導是否是miR-29a保護膿毒癥后腎功能的作用機制,目前還不清楚。本文表明,GSK-3β/Nrf2信號介導膿毒癥導致的腎損傷過程。另外本文通過雙熒光素酶報告基因法證實了miR-29a可以靶向下調GSK-3β的表達,由此可知,miR-29a可通過靶向下調GSK-3β表達,進而調控Nrf2信號通路,減輕膿毒癥大鼠腎組織氧化應激反應。

綜上,miR-29a可通過調控GSK-3β/Nrf2信號傳導調節氧化應激反應,進而介導膿毒癥腎損傷病理過程,過表達miR-29a可增強組織細胞抗氧化活性,阻滯炎性級聯反應進展,降低腎組織過氧化損傷,最終改善膿毒癥大鼠腎功能,靶向下調GSK-3β的表達是其分子機制,本文為膿毒癥后腎衰竭的防治提供了新的指導,有利于改善膿毒癥患者預后。