氧化苦參堿調(diào)控CDK4/cyclinD1通路誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡的細胞周期調(diào)控機制

陳林金 謝應(yīng)玉 陳丹 林師雅

(海南省中醫(yī)院,海南 海口 571500)

前列腺癌是一種常見的男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,該病早期癥狀并不明顯,發(fā)病率較高且呈現(xiàn)增長趨勢〔1～3〕。患者發(fā)病前期無特異性癥狀,中后期多發(fā)尿頻、尿急、尿不盡、尿費力等表現(xiàn)。前列腺癌早期患者可以通過前列腺癌根治術(shù)、手術(shù)或者藥物去勢等方法治療〔4〕,一般早期患者經(jīng)治療后都可以痊愈,但晚期患者以保守治療(化療)為主〔5〕。目前,采用中藥治療腫瘤是國內(nèi)外醫(yī)學研究的熱潮〔6〕,氧化苦參堿是近年來被廣泛研究探索的新種類中藥成分〔7〕,是純植物性質(zhì)的中藥材,具備抵抗癌癥、利于排除尿液、抵抗病原體入侵體內(nèi)、增強免疫等多種優(yōu)點,具備抗腫瘤低毒性等特點〔8〕。部分研究資料表明,氧化苦參堿對肺癌、胃癌等癌癥治療具備較好效果〔9〕。因此其抗腫瘤作用被研究人員重點關(guān)注。本文旨在研究氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞增殖、凋亡、細胞周期及細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4/細胞周期蛋白(cyclin)D1通路調(diào)控方面的作用,探討其對前列腺癌可能產(chǎn)生的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 PC-3細胞購自上海冠導生物工程有限公司〔物質(zhì)數(shù)字識別號碼(CAS):GD-C518891〕;氧化苦參堿購自武漢熠嘉生物科技有限公司(CAS:16837-52-8,純度≥98%);新生胎牛血清購自蘇州千舍生物科技有限公司(CAS:P30-3306);胰蛋白酶(Trypsin)、RPMI1640 培養(yǎng)基購自上海慧穎生物科技有限公司;噻唑藍(MTT)購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司。細胞周期檢測試劑盒購于碧云天公司;兔抗 p16、cyclinD1、CDK4 及 β-肌動蛋白(actin)一抗與兔二抗均購自美國 Sigma公司。

1.2細胞培養(yǎng) PC-3細胞種入培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)1 d,達80%～90%時,棄培養(yǎng)液清洗,0.25%胰酶消化3 min,RPMI1640培養(yǎng)液重懸,1∶3 傳代,于25 cm2的培養(yǎng)瓶中接種。

1.3MTT法觀察PC-3細胞增殖 取2×105/ml濃度懸液100 μl種于96孔板,孵箱培養(yǎng)至細胞貼壁單層鋪滿孔底。對照組加等量培養(yǎng)液,氧化苦參堿設(shè)2、4、8 μmol/L 3個濃度,每組設(shè)6個重復孔,藥物分別作用 24、48、72 h 后,每孔加 20 μl(5 mg/ml)MTT,4 h后棄培養(yǎng)基,加DMSO,振蕩10 min計算細胞增殖率。

1.4Hoechst33258 染色觀察PC-3細胞核 取5×105/ml濃度單細胞懸液于含消毒玻片的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h換培養(yǎng)基。給藥組加入氧化苦參堿2、4、8 μmol/L(2,4,8 μmol/L氧化苦參堿組),另設(shè)對照組。24 h鏡下觀察。

1.5流式細胞儀觀察PC-3細胞凋亡、周期 取5×105/ml濃度單細胞懸液于含消毒玻片的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h換培養(yǎng)基。收集培養(yǎng)24 h的所有細胞,1 000 r/min 離心 5 min,棄上清,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,1 200 r/min 離心 5 min,吸盡上清,加70%乙醇固定,碘化丙啶(PI)染色 30 min 。流式細胞儀分析細胞凋亡、周期情況。

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法觀察CDK4、cyclinD1 mRNA表達 取5×105/ml濃度單細胞懸液于含消毒玻片的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h換培養(yǎng)基,進行RNA 提取與純化,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作步驟根據(jù)說明書操作。

1.7Western印跡觀察CDK4、cyclinD1蛋白表達情況 取5×105/ml濃度單細胞懸液于含消毒玻片的培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h換培養(yǎng)基。細胞以 5×109/L 接種至6孔板,給藥各組對應(yīng)處理,提總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量檢測。按每個樣品25 μl上樣后進行電泳分離蛋白質(zhì)。電泳,封閉1 h后,將一抗與膜4 ℃孵育過夜(cyclinD1及CDK4,體積分數(shù)為1∶1 000),二抗以1∶10 000 室溫孵育2～3 h,電化學發(fā)光法顯色成像,分析條帶灰度值,檢測cyclinD1、CDK4蛋白表達水平。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行F或t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1MTT法觀察前列腺癌PC-3細胞增殖情況 2、4、8 μmol/L氧化苦參堿組前列腺癌PC-3細胞24、48、72 h增殖率均顯著低于對照組(P<0.05),且各給藥組隨著氧化苦參堿濃度增加和時間延長增殖率均顯著下降,兩兩比較差異顯著(均P<0.05)。氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞的增殖有抑制作用,見表1。

2.2熒光染色觀察前列腺癌PC-3細胞核形態(tài)改變情況 與對照組相比,經(jīng)氧化苦參堿作用的細胞皺縮,染色質(zhì)濃縮邊集。對照組凋亡細胞不顯著。隨著氧化苦參堿濃度增加,細胞核更加皺縮,見圖1。

2.3流式細胞儀觀察前列腺癌PC-3細胞凋亡率與細胞周期情況 對照組,2、4、8 μmol/L氧化苦參堿組凋亡率依次增加,G1期比例依次上升,S期、G2比例依次下降,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表2、圖2。

2.4PCR法觀察CDK4、cyclinD1 mRNA表達情況 與對照組相比,氧化苦參堿組CDK4和 cyclinD1 mRNA表達明顯下降,氧化苦參堿濃度越高,CDK4和 cyclinD1 mRNA表達下降越明顯,兩兩比較差異顯著(P<0.05),見表2。

2.5Western印跡觀察CDK4、cyclinD1蛋白表達情況 與對照組相比,2、4、8 μmol/L氧化苦參堿組CDK4、cyclinD1蛋白表達顯著降低,4、8 μmol/L氧化苦參堿組CDK4和cyclinD1蛋白表達水平明顯低于2 μmol/L氧化苦參堿組(P<0.05),見表2、圖3。

表1 不同時間點氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞增殖的影響

圖1 氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞核形態(tài)的影響(Hoechst33258染色,×400)

表2 氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞凋亡與周期及CDK4、cyclinD1表達的影響

圖2 氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞凋亡的影響

1～4:對照組、2 μmol/L氧化苦參堿組、4 μmol/L氧化苦參堿組、8 μmol/L氧化苦參堿組圖3 氧化苦參堿對前列腺癌PC-3細胞CDK4、cyclinD1蛋白表達的影響

3 討 論

氧化苦參堿,是純植物性質(zhì)的中藥材,具備抵抗癌癥、利于排除尿液、抵抗病原體入侵體內(nèi)、增強免疫等多種優(yōu)點。其抗腫瘤、低毒性等特點被相關(guān)研究證實,因此將其廣泛應(yīng)用于多種癌癥的臨床治療。本文實驗結(jié)果指出,氧化苦參堿可以抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖率,且濃度越高,氧化苦參堿對前列腺癌的增殖抑制作用越明顯,這與張明發(fā)等〔8〕的研究結(jié)果相一致。通過熒光染色發(fā)現(xiàn),經(jīng)氧化苦參堿作用后的前列腺癌PC-3細胞發(fā)生皺縮,其染色質(zhì)濃縮邊集,且細胞變化與氧化苦參堿的濃度密切相關(guān),作用濃度越高,細胞形態(tài)改變越明顯,這與顏為紅等〔10〕的研究結(jié)果相類似。

癌癥的發(fā)生發(fā)展與細胞周期的變化密切相關(guān),細胞周期失調(diào)是癌癥的標志。細胞周期的調(diào)節(jié)因子中就包括多種癌基因和抑癌基因。細胞增殖的完整周期中,G1 期與 S 期間的調(diào)控點是關(guān)鍵。正常細胞從G1期向S期的調(diào)控需要 cyclinD1的正調(diào)控和 p16 的負調(diào)控來完成〔11,12〕。研究結(jié)果表明,氧化苦參堿干預(yù)前列腺癌PC-3細胞24 h 后,存在 G1/S 阻滯;細胞凋亡率也隨濃度增加而上升,這與何禮蓮等〔13〕的研究結(jié)果相類似。由此推測,氧化苦參堿可能通過阻滯前列腺癌PC-3細胞G1 期向 S 期的進程,形成 G1 期阻滯,使得 G1期細胞淤積成堆、停滯不前,使得細胞 DNA 合成、復制的中斷,細胞周期的循環(huán)停滯,從而達到對腫瘤細胞增殖的抑制作用〔14〕。本文結(jié)果說明,氧化苦參堿通過調(diào)控了 G1 期這些細胞周期正負調(diào)節(jié)因子表達發(fā)揮作用,抑制細胞周期進展,導致腫瘤細胞凋亡,這與張緒慧等〔15〕的研究結(jié)果相類似。

綜上所述,氧化苦參堿抑制前列腺癌PC-3細胞增殖活力,誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡并在細胞增殖周期G1期中阻滯,其中的作用機制可能與CDK4/cyclinD1通路密切相關(guān)。