檳榔愈傷中檳榔堿的提取方法

李香凝，趙 瑾，李東棟,2，鄭育聲

（1. 海南大學 熱帶作物學院 ，海口 570228; 2. 海南大學 三亞南繁研究院，海南 三亞 572025）

棕櫚科檳榔屬植物檳榔（Areca catechu），具有極高的藥用價值。我國的四大南藥之首——榔玉，即為其成熟的種子經炮制處理后形成的。目前，檳榔在國內主要種植于海南、云南、福建、廣西和臺灣等地，為海南省支柱性商業作物[1,2]。檳榔中蘊含著豐富的天然活性物質，如脂肪酸、多酚、鞣質、氨基酸、生物堿、多糖、檳榔紅色素以及皂苷等，其中，脂肪酸（14%～18%）和鞣質（13%～27%）的含量較多，其次為生物堿（0.3%～0.6%）[3]。檳榔中最少含有6 種生物堿，其中檳榔堿的含量最多，具有一定的藥用價值。檳榔堿可通過作用于下丘腦- 垂體- 腎上腺軸從而影響內分泌系統[4]，有研究發現，檳榔堿可興奮膽堿M 受體，使人唾液分泌增加、出汗、亢奮等，利于人體消化[5]。但是也有研究表明，咀嚼食用檳榔與患有口腔癌具有極大相關性[6]，體外實驗也表明，檳榔提取液可引起局部腫瘤變化。檳榔堿是檳榔的主要活性物質，具有極強的擬副交感神經毒理作用、細胞毒活性等幾種毒理作用[7]，檳榔堿還可引起口腔黏膜角質細胞凋亡，并顯著增加口腔黏膜成纖維細胞中S100A4 蛋白的表達，進而可能導致口腔黏膜下纖維性變（oral submucous fibrosis，OSF），是導致口腔黏膜細胞癌變的主因[8]。此外，檳榔堿不但會致癌，還會使整個機體的免疫功能下降，增加患癌風險[9]。檳榔堿對生殖系統具有一定毒理作用，研究指出，檳榔堿可導致男性精子數目下降，且表現出對檳榔堿的劑量依賴性[10]。檳榔樹木高大、生長年限較長，且都生長于室外受外界環境影響，對其進行研究無法直觀檢測，因此，大部分關于檳榔堿的研究都是在其果實中進行。愈傷組織具有多種用途，一方面可研究植物生長發育及分化的機制、遺傳變異規律，對植物遺傳育種具有特殊意義；另一方面可用于大規模工廠化生產有用化合物，或用于細胞培養篩選工業、農業、醫藥生產上有用的無性系，或用于原生質體培養中的原生質體來源等[11]。愈傷組織的獲取來源廣泛，可以從植物的花、葉片、莖和種子等進行誘導獲得，且誘導的愈傷組織量較大，可以對植物進行更多方向的研究。

檳榔堿含量的準確測量對于研究檳榔愈傷中檳榔堿的變化十分重要。目前，檳榔堿的提取方法主要有加熱回流提取法、超聲波提取法、亞臨界水提法、超臨界流體萃取等方法；分析方法有滴定法、分光光度法、高效液相色譜法以及液相色譜質譜聯用技術等方法[12]。現有的檳榔堿提取方法均存在材料用量多、提取時間長以及步驟繁瑣等缺點；而關于檳榔愈傷組織的研究內容較少，加上目前檳榔愈傷組織材料數量有限，因此，本研究擬以檳榔愈傷為材料，采用超聲波提取方法，選擇料液比、提取時間、提取溫度、提取次數4 個因素，在單因素實驗的基礎上，進行L9（34）正交實驗，根據單因素實驗和正交實驗的結果進行驗證實驗，研究檳榔愈傷中檳榔堿的提取體系，以期建立一種簡便、快速并且樣品用量少的測定檳榔愈傷中檳榔堿含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料選擇2 種實驗材料，一種是在海口街頭采買的新鮮檳榔果,另一種是由海南大學熱帶棕櫚植物實驗室以檳榔葉片誘導分化得到的檳榔胚性愈傷組織。選擇的檳榔愈傷組織直徑約1 cm、外形呈乳白色、質地與生花生類似（圖1）。將果和愈傷組織進行凍干，粉碎后過0.25 mm 篩后備用。因為粉碎粒過0.25 mm 篩后，檳榔堿的含量最高[13]。

圖1 檳榔葉片誘導的檳榔愈傷組織

1.2 檳榔愈傷中檳榔堿提取方法的建立

1.2.1 繪制標準曲線1）確定最大吸收波長 使用85%的乙醇將檳榔堿標準品配制為1.0 g·L-1氫溴酸檳榔堿的標準液，然后將85%的乙醇作為空白對照，使用紫外可見分光光度計對1.0 mg·mL-1檳榔堿的標準液進行全波長掃描，發現氫溴酸檳榔堿的最大吸收峰在233 nm 處。

2）繪制標準曲線 以85%的乙醇為溶劑將氫溴酸檳榔堿標準品分別配制成0.02、0.06、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0 mg·mL-1的標準液，然后以85%的乙醇為空白對照，在233 nm 處對所有梯度濃度的標準液進行掃描，得出其吸光度值。然后將氫溴酸檳榔堿的質量濃度設置為自變量（X），吸光度值A設置為因變量（Y），使用origin 軟件對不同濃度氫溴酸檳榔堿的標準液的吸光度值進行分析，得到標準曲線和回歸方程。

1.2.2 檳榔堿的提取及檢測檳榔堿提取和檢測方法較多，考慮筆者所在的實驗室現有的技術以及后續對檳榔愈傷所進行的其他實驗，因此利用超聲波提取的方式進行檳榔堿提取，使用紫外分光光度法進行含量檢測。

取0.1 g 樣品于2 mL 離心管中，加入100 μL氨水浸潤2 min。然后，使用移液槍在離心管內加入一定量的85%的乙醇，在超聲功率為300 W、超聲頻率40 kHz 的情況下，控制水浴溫度、超聲時間、超聲次數進行超聲波提取。最后收集提取液并使用過濾柱頭過濾，使用HBr 將濾液pH 調至3～4，得待測液。然后以85%的乙醇為空白對照，在233 nm 處對所得待測液進行測量，測量其吸光度值。

1.3 單因素分析在綜合考慮料液比、提取時間、提取溫度和提取次數對檳榔愈傷中檳榔堿含量影響的基礎上，設計單因素實驗，每組設置3 個重復。

1.3.1 料液比稱取粉碎粒度0.25 mm 的檳榔愈傷組織和檳榔果粉末0.1 g 于2 mL 離心管中，分別按照料液比（m檳榔愈傷-檳榔果∶V乙醇）為1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12 的比例加入800、900、1 000、1 100、1 200 μL 體積的85%的乙醇，在65 ℃水浴中超聲波提取20 min，共提取3 次，紫外分光光度法測量檳榔堿含量。

1.3.2 提取時間將0.1 g 檳榔愈傷組織和檳榔果粉末加入2 mL 的離心管中，按照1∶10 的料液比加入1 000 μL85%乙醇，在65 ℃水浴中分別按超聲波10、15、20、25、30 min 的分組進行提取，每組提取3 次，用紫外分光光度法測量檳榔堿含量。

1.3.3 提取溫度將0.1g 檳榔愈傷組織和檳榔果粉末加入2 mL 的離心管中，按照1∶10 的料液比加入1 000 μL85%乙醇，分別在35、45、55、65、75、85 ℃的水浴鍋中超聲提取20 min，共提取3 次，用紫外分光光度法測量檳榔堿含量。

1.3.4 提取次數將0.1 g 檳榔愈傷組織和檳榔果粉末及1 000 μL 85%的乙醇加入2 mL 的離心管中充分混勻。然后，于75 ℃中超聲提取20 min，分別重復提取0、1、2、3、4 次，每組重復3 次。用紫外分光光度法測量檳榔堿含量。

1.4 正交實驗本實驗室目前具有成熟的檳榔愈傷組織的誘導體系，但是數目上還存在一定的限制，無法進行大批量的檳榔堿提取。通過單因素檳榔果和檳榔愈傷中檳榔堿的變化趨勢，發現兩者存在一致性，因此，選擇使用檳榔果進行正交實驗，得到檳榔堿提取的最佳方式。根據單因素實驗的結果，分別選擇料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、提取次數（D）4 個因素的3 個水平（表1）按照L9（34）正交設計表（表2）進行實驗。

表1 因素水平表

表2 正交實驗設計表

1.5 驗證實驗對檳榔果中檳榔堿的提取進行正交實驗，由于正交實驗結果中的最佳提取工藝與單因素實驗得到的最佳提取條件不一致，所以進行驗證實驗。分別稱取檳榔果殼粉末和檳榔愈傷粉末0.1 g 于2 mL 離心管中，然后按照A1B3C3D3和A2B2C3D2兩個條件組合進行3 次平行實驗。

1.6 數據處理每個樣品選取3 個生物學重復，使用SPSS 軟件對所得數據進行統計分析，用t測驗進行數據之間的比較，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）。用GraphPad和Excel 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 檳榔愈傷中檳榔堿標準曲線的建立使用origin 軟件對測量結果進行分析，以檳榔堿的標準液濃度為X軸坐標，吸光度為Y軸坐標，進行線性擬合，繪制標準曲線（圖2），得出回歸方程為Y=0.0347+4.1046X，R2=0.999，線性范圍為0.02～0.4 mg·mL-1。

圖2 檳榔堿標準曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對檳榔堿提取的影響從圖3 可知，隨著料液比的不斷增大，檳榔堿的提取效率越高，當料液比達到 1∶10 時，檳榔堿含量最多，而當料液比大于1∶10 時，隨著85%乙醇劑量的增多，檳榔堿的含量反而逐漸下降，而且檳榔愈傷中檳榔堿的含量高于檳榔果中的含量。原因可能是當檳榔愈傷和果的量一定時，溶劑的量越多，溶劑與待萃取物的接觸越充分，溶解在萃取液中的檳榔堿含量越多，當溶劑的體積達到1 000 μL 時，檳榔材料中的檳榔堿被充分提取。當溶劑的體積大于1 000 μL 時，由于檳榔堿的含量一定，而溶劑的總體積增加，檳榔堿的濃度被稀釋，所以隨著料液比的不斷增加，檳榔堿的含量逐漸減小。因此，選擇料液比為1∶10 進行檳榔堿的提取較為合適。

圖3 料液比對檳榔堿提取的影響

2.2.2 提取時間對檳榔堿提取的影響由圖4 可知，隨著提取時間的延長，檳榔堿在溶劑中的溶解度越來越高，在25 min 時檳榔堿含量最高，但是當提取時間大于20 min 時，檳榔堿完全溶解在液體中，含量不會隨著時間的增加而大量增加。考慮到實驗的時間成本，選擇20 min 作為檳榔堿的提取時間。

圖4 提取時間對檳榔堿提取的影響

2.2.3 提取溫度對檳榔堿提取的影響由圖5 可知，溫度的提高有助于增大擴散系數，有利于檳榔堿溶解在溶劑中，因而隨著溫度的不斷提高，檳榔堿的含量也在不斷提升。但是當溫度過高時檳榔堿的含量反而下降，可能的原因有：1）過高的溫度引起溶劑的揮發，使得檳榔堿的提取率下降；2）乙醇與水之間的互溶度隨溫度升高而增大，使提取效果下降；3）溫度過高導致檳榔堿的分子被破壞，從而使得提取率下降。分析后選擇75 ℃進行后續實驗。

圖5 提取溫度對檳榔堿提取的影響

2.2.4 提取次數對檳榔堿提取的影響由圖6 可知，隨著提取次數的增加檳榔堿的含量不斷增加，當提取次數達到3 次及以上時，所提取出的檳榔堿的含量基本不變，這時候檳榔堿的含量已達到最大值，說明3 次已基本提取完全。綜合考慮，檳榔堿提取4 次為最佳條件。

圖6 提取次數對檳榔堿提取的影響

2.3 正交實驗正交實驗（表3）表明，4 個因素對檳榔堿提取的影響順序為料液比、提取時間、提取次數、提取溫度，以檳榔堿含量為指標的檳榔堿的最佳提取工藝A1B3C3D3，即料液比1∶9、提取時間30 min，提取溫度75 ℃、提取次數4 次。此外，將極差最小的C 項作為誤差項對正交結果進行方差分析（表4）。由結果可知，料液比、提取時間對檳榔堿提取有顯著影響，而提取次數影響不顯著。

表3 正交實驗結果

表4 正交實驗結果方差分析

2.4 驗證實驗由圖7 可知，正交實驗得出的最佳工藝的提取效果最好，并且對于檳榔愈傷的檳榔堿提取效果更佳。

圖7 驗證實驗結果

3 討 論

本研究通過單因素實驗分析檳榔愈傷組織和檳榔果中檳榔堿的含量變化，有研究結果顯示，在檳榔下腳料中檳榔堿的提取中，綜合考慮6 種單因素對檳榔堿含量的影響[13]，相比來說本研究選擇的單因素較少，不具備全面性，無法準確地指出現在得到的檳榔堿的提取方式是否已經是最優的提取條件，后續可以增加單因素研究。且本研究中，正交實驗是利用檳榔果進行的，雖然進行了驗證實驗證明了檳榔愈傷中檳榔堿的含量高于檳榔果，但是數據不夠全面，待后續檳榔愈傷組織大量繁殖之后進行合適的正交實驗。

高效的提取方式是檳榔堿提取過程中最有效的手段，筆者在綜合考慮本實驗室所擁有技術的基礎上選擇超聲波提取和紫外分光光度法進行檢測。超聲波提取可通過傳質，加熱和空化作用來提高提取率并縮短提取時間[14]，超聲波獨有的物理特性可破壞植物細胞，從而使得其中的活性成分提取更充分，顯著提高提取率、縮短提取時間。超聲波提取還具有操作簡便、運行成本低的優點，因而被廣泛應用于藥用植物中有效成分的提取。紫外分光光度法操作簡便，儀器成本較低，但是無法滿足檳榔堿的痕量檢測。本研究中檳榔堿的提取和檢測方式不夠新穎，檢測時液體中含有的雜質對實驗結果造成一定的影響，之后可以使用更加精準的檢測方式得到檳榔堿的含量。

愈傷組織是根癌農桿菌遺傳轉化的最佳受體材料，因此關于檳榔愈傷組織材料的研究對檳榔未來各種研究是非常重要的。本研究是利用檳榔愈傷組織進行檳榔堿的提取，目前關于檳榔愈傷的研究較少，因此本研究所選擇的材料新穎，具有創新性。檳榔愈傷組織繁殖速度快，未來可以對檳榔中生物堿含量進行分析，對于研究檳榔中分子代謝機制是非常合適的研究材料。

本實驗通過對檳榔果和檳榔愈傷進行單因素和正交實驗分析，建立了一個簡便、快速、樣品用量少，并且可大批量進行實驗的，提取檢測檳榔愈傷中檳榔堿的體系，結果顯示，提取檳榔堿的最優條件為：75 ℃的提取溫度，每0.1 g 原料添加900 μL 85%乙醇，每次提取30 min，共提取4 次。用該提取條件分別提取檳榔愈傷和檳榔果殼中的檳榔堿，發現愈傷中的檳榔堿含量高于果殼，該提取方法可保證在小劑量使用檳榔愈傷、減少材料消耗的情況下，又可快速檢測檳榔堿含量。目前，本研究獲得了現今最優的檳榔愈傷中檳榔堿提取方式，本實驗室后續進行的研究是關于外來施加脅迫對檳榔愈傷中檳榔堿的影響，該提取方式為后續實驗打下良好基礎，也為未來檳榔分子方向的研究提供了新思路。