醫源性因素早發性卵巢功能不全家兔模型建立

閆 麗, 金格雅,2, 王愷悅, 王喜良, 于月新

1.北部戰區總醫院 生殖醫學科,遼寧 沈陽 110016;2.中國醫科大學研究生院,遼寧 沈陽 110122

早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性在40歲以前出現卵巢功能衰退,是女性不孕的主要原因之一[1]。POI患者促性腺激素水平升高(促卵泡生成素>25 U/L)、雌激素水平下降,主要表現為月經異常(稀發或閉經)[2],誘發更年期癥狀,如潮熱、盜汗、失眠等,增加心血管疾病和骨密度降低的風險[3]。有研究表明,POI在我國的發病率約1%[4],其受到遺傳、免疫、化療等醫源性因素、環境、心理因素的影響,發病率逐年增長且患病群體年輕化[5-6]。目前,POI發病機制還不明確,缺乏有效的治療手段和藥物,因此,找到安全且有效的治療方案成為亟待解決的問題。建立動物模型是研究發病機制及治療效果的常用方法,根據不同的發病機制,POI的動物模型制備方法主要有化學損傷藥物造模法[7-8]、半乳糖代謝造模法[9]、基因敲除造模法等[10-11]。化療損傷藥物模型是研究POI的經典模型。化療藥物環磷酰胺造價低,可用于治療惡性腫瘤、系統性紅斑狼瘡、腎病綜合征等[5,12-13]。環磷酰胺通過促進卵巢顆粒細胞凋亡并對不同發育階段的卵泡造成損傷,使卵泡發育受阻,引起性激素水平變化,進而導致卵巢功能障礙[14]。本研究通過比較不同劑量的環磷酰胺對新西蘭白兔卵巢功能的影響,探究建立化療損傷性POI家兔模型的最佳給藥方案,以期為臨床研究提供一種安全、可靠的模型構建方案。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級雌性未交配新西蘭白兔32只,5月齡,體質量2.7～2.9 kg,由青島康大生物科技有限公司提供[ SCXK(魯)2020-0003],飼養于北部戰區總醫院實驗動物部,給予全價營養飼料,保持室溫在20℃～24℃,相對濕度在45%～50%,模擬正常晝夜生理節律,每天光照12 h,自由飲水和進食。所有動物實驗均按照本院實驗中心的規范要求,符合動物倫理委員會指導原則(倫理批號第2020-08號)。

1.2 主要試劑及設備 注射用環磷酰胺購自德國Baxter Oncology GmbH公司(注冊證號H20160467),0.2 g/瓶,注射前用生理鹽水配成40 mg/ml新鮮水溶液備用;兔雌二醇酶聯免疫檢測試劑盒、兔促卵泡生成素酶聯免疫檢測試劑盒均購自上海江萊生物(貨號JL22071、JL22073);烏拉坦購自上海麥克林生化科技有限公司(貨號U820333);蛋白提取試劑盒Protein Ext Mammalian Total Protein Extraction Kit購自全式金公司(貨號DE101-01);BCA蛋白定量試劑盒購自天根公司(貨號PA115);Bax、Bcl2、Tubulin蛋白抗體均購自Proteintech公司(貨號50599-2-lg、12789-1-AP、11224-1-AP);Goat HRP anti-Mouse購自invitrogen公司(貨號31460);BY-600A型離心機購自北京白洋醫療器械有限公司;Leica RM225切片機、Leica EG1150包埋機均購自德國Leica Biosysterms Nussloch GmbH公司;BX51顯微鏡購自日本Olympus公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳槽購自日本Bio-craft(貨號BE-230);半干轉膜儀購自美國Bio-Rad。

1.3 動物分組及實驗干預 根據臨床上環磷酰胺化療的用藥方案,分為小劑量持續治療組和大劑量沖擊治療組,適應性喂養1周后,采用隨機數字表法將32只新西蘭兔分成4組,每組各8只。A組為正常對照組;B組50 mg/kg腹腔注射環磷酰胺1 d,8 mg/kg連續注射14 d;C組50 mg/kg連續腹腔注射環磷酰胺3 d;D組100 mg/kg連續腹腔注射環磷酰胺3 d。模型組家兔雌二醇水平降低、促卵泡生成素升高且與正常對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05),卵巢卵泡數目顯著減少表明POI模型構建成功。

1.4 動物取材及處理 各組家兔造模3周后,耳緣靜脈取血,收集于5 ml采血管中。隨后經耳緣靜脈注射過量20%烏拉坦溶液致兔安樂死,取家兔雙側卵巢,一側卵巢置于凍存管中,置于-80℃冰箱凍存,另一側卵巢放入10%中性甲醛溶液中固定至少24 h。血液標本室溫下靜置2 h后,3 000 r/min離心10 min,將上層血清分裝至1.5 ml離心管,每管300 μl,置于-80℃冰箱保存。

1.5 家兔體質量及卵巢指數 造模開始后,觀察家兔的活動情況、進食量及兔毛脫落情況。每周對家兔進行稱重并記錄,造模結束后,取兩側卵巢,小心剝離多余脂肪組織,測量卵巢長徑并用電子天平稱濕重,計算卵巢指數。

卵巢指數=(卵巢濕重/體質量)×100%

1.6 卵巢組織學形態及卵泡數目 卵巢組織經10%中性甲醛溶液固定后,進行石蠟包埋,切成4 μm切片,HE染色后,在光鏡下觀察卵巢組織形態,計數各級卵泡[4],計算閉鎖卵泡/卵泡總數的比值(閉鎖卵泡占比)。原始卵泡定義為卵母細胞被一層鱗狀顆粒細胞包圍;初級卵泡的卵母細胞被一層立方顆粒細胞包圍;次級卵泡由一層以上的立方顆粒細胞包圍,尚未形成囊腔;早期的竇卵泡開始出現囊腔,排卵前的竇卵泡出現明顯的層級云顆粒細胞層;閉鎖卵泡的卵母細胞萎縮,形態不規則,透明帶深染。各級卵泡分類見圖1。

圖1 各級卵泡分類(a.原始卵泡;b.初級卵泡;c.次級卵泡;d.竇卵泡;e.閉鎖卵泡)

1.7 血清激素水平檢測 血清樣本采用酶聯免疫吸附實驗法檢測促卵泡生成素、雌二醇的水平,按照試劑盒說明書操作。(1)標準品的稀釋。(2)加樣:分別設置空白孔、標準孔、待測樣品孔。加樣體積為50 μl,樣品使用樣品稀釋液稀釋5倍加樣。(3)每孔加入50 μl Biotin-抗體工作液。(4)37℃溫浴1 h后洗滌。(5)加酶:每孔加入100 μl酶結合物工作液,37℃溫浴30 min后洗滌。(6)顯色:加入底物(TMB)90 μl,37℃避光溫浴30 min。(7)終止:每孔加入50 μl終止液。(8)在450 nm波長處測各孔的吸光度值。

1.8 卵巢組織蛋白檢測 按照試劑盒說明書,提取卵巢組織中的Bax和Bcl2蛋白[5]并進行免疫印跡分析。具體步驟如下:凍存組織取出后,加入1 ml組織裂解液,使用勻漿器快速研磨使其裂解,隨后進行蛋白定量,通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,半干轉的方式轉至PVDF膜,5%牛奶室溫封閉1 h,孵育一抗4℃過夜,TBST洗滌3次,每次10 min,孵育二抗室溫1 h,TBST洗滌3次,每次10 min,ECL化學發光液進行顯影并分析結果。

2 結果

2.1 4組家兔狀態比較 除A組外,給藥3 d后,剩余3組家兔均出現不同程度脫毛;B組兔毛枯燥暗淡,少量脫落,進食未受影響;C組和D組家兔精神萎靡,進食減少,面部毛發脫落嚴重,C組在建模2周后有所恢復,D組內有2只家兔在給藥5 d后死亡。

2.2 4組家兔體質量比較 造模前,A、B、C、D組家兔體質量比較,差異均無統計學意義(P>0.05);經腹腔注射環磷酰胺造模3周后,C組和D組家兔體質量均低于A組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組家兔體質量比較

2.3 4組家兔卵巢長徑及卵巢指數比較 經腹腔注射環磷酰胺造模3周后,C組和D組家兔卵巢長徑均短于A組,卵巢指數均小于A組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組家兔卵巢長徑和卵巢指數比較

2.4 4組家兔各級卵泡計數及閉鎖卵泡占比比較 A組卵巢卵泡數量多,各級卵泡顆粒細胞排列規則,多為生長卵泡,閉鎖卵泡數量少;B組原始和初級卵泡數量少于A組(P<0.05),竇卵泡形態不規則,閉鎖卵泡數量多于A組(P<0.05);C組、D組卵泡總數減少,原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡數量少于A組(P<0.05),次級卵泡的顆粒細胞排列雜亂,竇卵泡形態不規則,異常卵泡增多,閉鎖卵泡數量多于A組(P<0.05)。C組和D組閉鎖卵泡占比高于A組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組家兔各級卵泡計數和閉鎖卵泡占比比較

2.5 4組家兔血清雌二醇及促卵泡生成素水平比較 經腹腔注射環磷酰胺造模3周后,C組和D組雌二醇水平低于A組,促卵泡生成素水平高于A組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組家兔血清雌二醇和促卵泡生成素水平比較

2.6 4組家兔卵巢組織Bax及Bcl2蛋白表達水平比較 與A組比較,B、C、D組Bax蛋白表達上調(P<0.05),Bcl2蛋白表達下調(P<0.05)。見圖2。

圖2 4組家兔卵巢組織Bax和Bcl2蛋白表達水平比較

3 討論

卵巢功能衰退是一種常見的婦科內分泌疾病,常引起原發或繼發不孕、低雌激素癥狀,如潮熱、多汗、性欲減退等,不僅會引起女性生殖內分泌功能障礙,還嚴重影響育齡婦女的身心健康和生活質量[15]。POI是卵巢早衰的早期階段,如果在卵巢損傷更嚴重之前實施有效的治療措施,能夠避免或延緩卵巢早衰的發生。

建立穩定的動物模型是治療研究的重要前提,目前,實驗研究采用各種方法造模。有學者發現,切除新生小鼠的胸腺后,絕大多數的小鼠出現自身免疫性卵巢炎癥及卵巢早衰[16]。在使用D-半乳糖建立卵巢早衰模型時,小鼠動情周期出現紊亂,卵泡減少,與臨床患者卵泡丟失、閉鎖、不排卵癥狀相符[9]。有研究表明,敲除小鼠PTEN基因后,小鼠原始卵泡減少,促卵泡生成素激素水平升高[10]。有研究通過腹腔注射環磷酰胺建立POI大鼠模型,單次注射50 mg/kg后、每天8 mg/kg連續注射8 d得到了理想模型,大鼠卵巢功能明顯衰退,卵巢組織學及內分泌變化均最接近臨床卵巢早衰患者[17]。

大多數研究選用大鼠或小鼠建立動物模型,本研究使用新西蘭白兔模擬化療藥物損傷卵巢模型,因為家兔卵巢組織更大,各級卵泡數量更多,卵母細胞更接近人類的大小。耳緣靜脈采血方便,對動物損傷小,符合動物倫理學要求,還可進行不同時間點激素水平的監測。本研究通過3種不同的給藥劑量建立POI模型,相較于A組,B組家兔原始和初級卵泡數量減少,閉鎖卵泡數量增多,但體質量、卵巢長徑、卵巢指數、激素水平、各級卵泡數量變化差異無統計學意義,表明這種給藥劑量對家兔整體影響較小,對卵巢的破壞較輕,無法用于建模。C組兔毛部分脫落,體質量下降較為平穩,卵巢受損嚴重,卵巢指數、卵泡數量、雌二醇和促卵泡生成素激素水平與A組比較差異明顯,更加符合POI的自然變化情況,更適宜建立POI模型。D組家兔卵巢受損情況嚴重,雖然激素水平、卵泡數量與A組具有顯著差異,但家兔狀態較差,進食量少,兔毛脫落嚴重,耐受性差,不適合用于造模進行后續研究。

綜上所述,50 mg/kg連續腹腔注射環磷酰胺3 d是建立化療損傷性POI家兔模型的最佳濃度,該方法簡便易行,卵巢損傷較穩定,動物耐受性好,能夠用于評估POI不同治療方案的預后效果,為臨床研究提供理論支持。