杜仲提取物增強骨髓基質細胞移植對創傷性腦損傷治療效能相關性研究

劉 欣, 劉 亮, 張 旭

北部戰區總醫院 1.神經內科;2.心血管外科,遼寧 沈陽 110016

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是全球范圍內致殘致死的主要原因之一[1]。TBI所導致的運動障礙等神經功能缺損長期存在,給患者造成痛苦和經濟負擔。TBI發生時,暴力直接作用于腦組織造成神經元死亡。原發損傷發生后,氧化應激、神經炎癥反應等繼發病理持續蔓延,可導致周圍區域神經元凋亡等繼發損傷。盡管有大量研究闡發TBI發病機制,但臨床上目前仍缺乏減輕TBI神經后遺癥的有效方法[2]?；诟杉毎浦驳闹委煼椒ㄓ兄谘a充和替代受損的神經元,并且能夠幫助重建受損的神經環路,促進TBI患者神經功能恢復。但干細胞來源有限、免疫排斥等問題是該療法應用的關鍵障礙。骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓來源、具有多向分化潛能的間充質干細胞[3]。BMSCs在骨髓中含量相對豐富且易于提取,用于自體移植可有效避免移植排斥,是理想的移植細胞。有研究報道,經多途徑移植的BMSCs可有效向組織損傷灶歸巢遷移,并可向神經元方向分化[4]。然而,誘導BMSCs分化為功能性神經細胞的穩定有效策略并不明確。杜仲(eucommia ulmoides,EU)是一種具有補肝腎、堅筋骨,補中氣等作用的中藥,含有苯丙素類(如綠原酸)、黃酮類、多糖類等多種生物活性成分[5]。藥理學和臨床研究發現,EU可產生持久的中樞性降壓效應,并能有效改善脊髓灰質炎后遺癥[5-6],提示EU可能具有神經功能調節和神經損傷修復作用。但EU能否誘導BMSCs等干細胞神經分化尚不清楚。本研究旨在探討EU提取物對BMSCs形態、增殖和神經分化等生物學特性的改變,明確EU預處理對BMSCs移植治療TBI神經功能障礙和組織損傷效能的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 40只3月齡(22～25 g)雄性C57BL/6小鼠(8只用于提取原代BMSCs、32只用于體內實驗)、8只3月齡(22～25 g)雄性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1O sb/J綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)轉基因小鼠購自南京生物醫藥研究院[合格證號:201706897;許可證號:SCXK(蘇)2015-0001],飼養于恒溫(21℃)、恒濕(50%)、12 h:12 h光照/黑暗周期的SPF級動物室。所有動物實驗按照北部戰區總醫院實驗動物管理及保護的有關規定進行(倫理號:2020-009)。

1.1.2 主要試劑 EU提取物(規格:杜仲綠原酸5%;恒興生物,張家界)、CCK-8試劑盒(貨號:C0037;碧云天,上海)、兔抗神經原纖維輕鏈(neurofilament light chain,Nefl)多克隆抗體(貨號:12998-1-AP;Proteintech,武漢)、兔抗微管相關蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)多克隆抗體(貨號:17490-1-AP;Proteintech,武漢)、小鼠抗GFP單克隆抗體(貨號:66002-1-Ig;Proteintech,武漢)、TRIzol試劑(貨號:15596026;Thermo Fisher,上海)、TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0(貨號:RR019A,TaKaRa,日本)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(貨號:RR820A,TaKaRa)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計與分組 體外實驗:將原代培養C57BL/6小鼠來源BMSCs接種于6孔板,分為EU組、Control組(每組8復孔),分別以添加EU提取物(100 μg/ml)和等量溶劑(0.9%生理鹽水)的基礎培養基培養14 d或70 d。通過相差顯微鏡觀察細胞形態變化。通過細胞融合度分析和CCK-8試驗檢測細胞增殖。通過NEFL和MAP2的免疫熒光(immunofluorescence,IF)染色及Oct4、Nefl、神經分化因子(neuro differentiation factor 1,Neurod1)和神經生長因子(nerve growth factor,Ngf)的定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測細胞神經分化。

體內實驗:將3月齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為Sham surgery組、TBI組、TBI+BMSCs組和TBI+EU_BMSCs組(每組各8只)。對TBI組、TBI+BMSCs組和TBI+EU_BMSCs組進行TBI手術。術后7 d,TBI組給予100 μl PBS,TBI+BMSCs組經眶內靜脈注射1×106無特殊處理的GFP轉基因小鼠來源BMSCs(100 μl PBS懸液),TBI+EU_BMSCs組經眶內靜脈注射等量EU提取物(100 ng/ml)預處理14 d的GFP轉基因小鼠來源BMSCs。Sham surgery組接受除TBI手術及細胞注射移植以外的其他操作。TBI術前1 d和術后1、3、7、10、14、17、21、24、28 d通過轉棒式疲勞儀和平衡木行走試驗檢測各組小鼠的運動功能。運動功能檢測全部完畢后處死動物,取材腦組織進行IF染色(GFP和MAP2)。

1.2.2 細胞培養 自3月齡C57BL/6小鼠或GFP轉基因小鼠股骨和脛骨髓腔吸取骨髓,在PBS中制成單細胞懸液,經200目篩網過濾、離心[TD-6M離心機,百典(上海)儀器設備,離心半徑16 cm,1 500 r/min,5 min]、棄上清、紅細胞裂解液孵育(2×106個細胞/ml,5 min)后,加入等量基礎培養基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12)終止裂解,離心(1 500 r/min,5 min)、棄上清,以基礎培養基培養于T75培養瓶(2×106個細胞/ml)。原代培養第4代細胞用于體外和體內實驗。

細胞生長融合度=待測細胞覆蓋率×100%

1.2.3 CCK-8檢測 細胞以原培養基接種于96孔板(2×105個細胞/ml,200 μl/孔,每組8孔)繼續培養48 h后,每孔加入20 μl CCK-8試劑,37℃孵育1 h,酶標儀讀取450 nm吸光度值(A450)。

相對細胞存活率=待測孔A450/Control組A450均值×100%

1.2.4 IF染色 檢測前將細胞接種于多聚賴氨酸包被蓋玻片(1×105個細胞/ml,每組8復孔)繼續培養48 h。細胞樣本經4%多聚甲醛固定10 min、0.5% Triton X-100透化處理5 min、5% BSA-PBS封閉1 h后,以一抗(兔抗NEFL多克隆抗體或兔抗MAP2多克隆抗體)工作液(5% BSA-PBS 1:100稀釋)4℃孵育過夜。樣本經0.1% BSA-PBS洗滌、在暗室中依次孵育二抗(山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 488)工作液(5% BSA-PBS 1:500稀釋)1 h和DAPI工作液(1 μg/ml)5 min、封固于50%甘油-PBS后,以BX51熒光顯微鏡(Olympus,日本)采集圖像。

將腦組織樣本制備為5 μm冰凍切片。切片經甲醇固定10 min、5% BSA-PBS封閉1 h后,以一抗(兔抗MAP2多克隆抗體和小鼠抗GFP單克隆抗體)工作液(5% BSA-PBS 1∶100稀釋)4℃孵育過夜。切片經PBS洗滌、在暗室中依次孵育二抗(山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 594和山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor 488)工作液(均以5% BSA-PBS 1∶500稀釋)1 h和DAPI工作液(1 μg/ml)5 min、封固于50%甘油-PBS后,以BX51熒光顯微鏡(Olympus,日本)采集圖像。

1.2.5 qRT-PCR 以TRIzol試劑提取細胞樣本總RNA。每樣本取500 ng RNA以TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒逆轉錄合成cDNA,以TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒在LightCycler?96 System(Roche,上海)中擴增cDNAs(反應體系及反應條件見試劑盒說明書;引物序列見表1)。以2-ΔΔCt方法分析數據[7]。以β-actin作為內參對照。

表1 引物序列

1.2.6 TBI模型手術 在10%水合氯醛麻醉(400 mg/kg)、腦立體定位儀固定下,對C57BL/6小鼠左側皮層上方開5 mm骨窗,采用改良Allen重物墜落打擊法制備中度TBI模型(重錘質量:10 g,下落高度:3 cm)。小鼠均損傷對側肢體癱瘓、不能直線爬行,即表明TBI造模成功[8]。

1.2.7 運動功能檢測 在轉棒式疲勞儀試驗中,記錄每只小鼠在旋轉軸(40 r/min)上停留時間。在平衡木行走試驗中,記錄小鼠通過平衡木(寬6.0 mm、長1.2 m、離地30.0 cm)時右后肢足失誤次數。

2 結果

2.1 EU提取物對BMSCs形態與增殖的影響 BMSCs貼壁生長,大多呈梭形、星形或多角形(圖1a)。EU提取物處理14 d后,細胞形態無明顯改變。暴露于EU提取物70 d后,細胞形態明顯改變,多數細胞呈長梭形,細胞突起明顯增多、延長,相鄰細胞突起交互連接形成網絡,部分細胞呈神經元樣形態。EU提取物處理14 d后,相差顯微鏡圖片量化分析顯示,EU組細胞生長融合度顯著高于Control組(P<0.001,圖1a、b);CCK-8檢測結果顯示,EU組細胞存活率較Control組增加約50%(P<0.001,圖1c)。

圖1 EU提取物對BMSCs形態與增殖的影響[a.相差顯微鏡圖片;b.細胞融合度分析,①P<0.001;c.細胞增殖CCK-8試驗,①P<0.001]

2.2 EU提取物對BMSCs神經分化的影響 IF染色結果顯示,EU提取物處理70 d后,EU組(65.05%±5.79%)細胞分化呈NEFL+(P<0.001,圖2a、b),(70.31%±5.46%)細胞呈MAP2+(P<0.001,圖2c、d),而Control組未檢出NEFL+和MAP2+細胞。qRT-PCR檢測結果顯示,EU提取物處理14 d后,EU組未分化干細胞標記物Oct4和成熟神經元標記物Nefl轉錄水平較Control組未發生明顯改變,而神經譜系分化特異性轉錄因子Neurod1和Ngf的表達量則明顯高于Control組,差異均有統計學意義(P<0.001,圖2e)。EU提取物處理70 d后,EU組Oct4 mRNA表達量低于Control組,而Nefl、Neurod1和Ngf轉錄水平高于Control組,差異均有統計學意義(P<0.001,圖2f)。

圖2 EU提取物對BMSCs神經分化的影響[a.NEFL的IF染色圖像;b.NEFL+細胞比例定量分析,①P<0.001;c.MAP2的IF染色圖像;d.MAP2+細胞比例定量分析,①P<0.001;e.EU提取物處理14 d后Oct4、Nefl、Neurod1及Ngf mRNA表達量qRT-PCR分析,①P<0.001;f.EU提取物處理70 d后Oct4、Nefl、Neurod1及Ngf mRNA表達量qRT-PCR分析,①P<0.001]

2.3 EU提取物對BMSCs移植治療TBI小鼠運動障礙效能的影響 轉棒式疲勞儀試驗顯示,與Sham surgery組小鼠比較,行TBI手術各組小鼠術后1 d轉棒停留時間降至術前1/3,差異有統計學意義(P<0.001)。與TBI組比較,TBI+BMSCs組小鼠術后14～28 d轉棒停留時間明顯延長,差異有統計學意義(P<0.001)。TBI+EU_BMSCs組術后17～28 d轉棒保持能力較TBI+BMSCs組進一步顯著增強,差異均有統計學意義(P<0.001)。見圖3a。平衡木行走試驗顯示,TBI+BMSCs組右后肢足失誤次數在術后10～28 d顯著少于TBI組,差異有統計學意義(P<0.05);TBI+EU_BMSCs組術后10～28 d通過平衡木時的足失誤次數則較TBI+BMSCs組進一步減少,差異有統計學意義(P<0.001)。見圖3b。

圖3 EU提取物對移植BMSCs治療TBI小鼠運動障礙效能的影響(a.轉棒式疲勞儀試驗;b.平衡木行走試驗)

2.4 EU提取物對移植BMSCs在TBI小鼠腦組織損傷灶內遷移及分化的影響 IF染色顯示,損傷28 d后,TBI組小鼠左側運動-感覺皮層損傷灶內MAP2表達量顯著低于Sham Surgery組,差異有統計學意義(P<0.001)。TBI+BMSCs組MAP2表達水平高于TBI組,差異有統計學意義(P<0.001);TBI+EU_BMSCs組MAP2表達量高于TBI+BMSCs組,但仍低于Sham Surgery組,差異均有統計學意義(P<0.001)。此外,TBI+EU_BMSCs組小鼠損傷灶內GFP+移植細胞含量及分化為MAP2+細胞的GFP+移植細胞比例均顯著高于TBI+BMSCs組,差異均有統計學意義(P<0.001)。見圖4。

圖4 EU提取物對移植BMSCs在TBI小鼠腦組織損傷灶內遷移及分化的影響[a.GFP與MAP2的IF雙重染色圖像;b.MAP2熒光強度定量分析;c.損傷灶內GFP+細胞含量定量分析;d.損傷灶內GFP+MAP2+細胞比例定量分析;①P<0.001]

3 討論

神經元損失是TBI導致運動功能障礙的重要病理基礎[9]。來源豐富、易于提取且具有神經分化潛能的BMSCs為TBI的自體移植細胞替代療法帶來希望[4,10]。然而,缺乏穩定高效的神經分化誘導方案是BMSCs移植治療TBI的關鍵限制因素。有研究報道,EU具有調節中樞神經系統功能、促進中樞神經損傷修復的作用[5-6]。

既往研究表明,EU活性成分可以促進細胞增殖,本研究也發現EU提取物可以使BMSCs生長和增殖代謝活性顯著提高[11]。同時,當EU提取物持續作用70 d后,原代BMSCs呈現確切的向神經元分化的跡象。這一變化說明,在EU提取物作用早期階段,BMSCs表達譜即出現向神經分化發育轉變的趨勢,此時BMSCs可能已具備合成分泌Ngf等神經營養因子促進神經損傷修復、調控神經系統再生微環境的潛能[12-15]。因此,本研究選取EU提取物預處理14 d、具有旺盛增殖活性并在轉錄本水平呈現神經分化傾向和神經損傷修復潛能的BMSCs作為主要移植細胞。

在體實驗中,本研究采用了轉棒式疲勞儀和平衡木行走試驗綜合評估一側皮層受損的TBI模型小鼠對側肢體肌力和整體運動協調性的損傷和恢復情況[16-17]。結果顯示,EU提取物預處理BMSCs治療小鼠在兩種運動試驗中運動功能的改善程度明顯高于一般BMSCs移植治療小鼠。既往研究表明,損傷灶局部可能存在神經分化再生誘導微環境[18-19],本研究發現,經眶內靜脈注射移植的GFP轉基因小鼠來源BMSCs可向TBI小鼠皮層損傷灶內歸巢遷移,并可在損傷灶內分化為MAP2+神經細胞。由于未治療小鼠損傷灶內僅存一定數量的MAP2,治療后TBI小鼠損傷灶內MAP2+神經細胞的恢復可能主要依賴于移植細胞分化。相較于一般BMSCs移植治療小鼠[20-23],接受EU提取物預處理BMSCs移植治療的TBI小鼠損傷灶內GFP+移植來源細胞明顯增多,可能與移植細胞遷移歸巢能力增強有關,另外也有可能得益于EU提取物的神經保護作用[24-25]。

綜上所述,EU提取物處理可促進BMSCs向神經元分化,并顯著提高BMSCs移植治療TBI的效能。本研究結果可為基于BMSCs移植的TBI細胞移植治療方案提供新思路和可靠的臨床前研究依據。EU何種活性成分發揮誘導BMSCs神經分化的主導作用,EU預處理BMSCs移植可分化為何種遞質類型功能性神經元、能否完全重建神經環路功能,仍有待進一步研究。