基于IL-17/NF-κB信號通路探討敦煌醫方大補脾湯聯合奧沙利鉑對胃癌荷瘤小鼠炎癥免疫的影響

曾元丁 蘇韞 龔紅霞 牛世偉 張晗

（甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅省高校重大疾病分子醫學與中醫藥防治研究省級重點實驗室，蘭州 730000）

近年隨著對炎癥與腫瘤關系研究的深入，研究重點轉變為慢性胃炎的“炎-癌轉化”模式［1-2］。研究表明胃癌患者腫瘤組織及血清中IL-17含量增加，NF-κB相關通路蛋白表達上升，表明胃癌組織中IL-17含量升高可使NF-κB水平上升，NF-κB信號通路下游IL-6表達增加，導致炎癥加重以及胃癌發生與發展［3］。

大補脾湯是敦煌醫理類著作《輔行訣臟腑用藥法藥》中的方劑之一，具有補虛扶正、化生氣血之功效，符合胃癌病因病機之一，本研究采用胃癌細胞MFC建立胃癌荷瘤小鼠模型，從免疫調節角度探討敦煌醫方大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及動物 小鼠胃癌細胞株MFC，批號：PNS-MC-20，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。60只SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，購自甘肅中醫藥大學動物實驗管理中心，合格證號：SCXK（甘）2020-0001。本研究根據甘肅中醫藥大學倫理委員會指導進行（2020-283）。

1.1.2 藥物 大補脾湯由人參15 g、黃芪15 g、當歸3 g、麥冬5 g、白術10 g、干姜15 g、炙甘草15 g、旋覆花5 g、五味子5 g組成，購自甘肅中醫藥大學附屬醫院，經甘肅中醫藥大學中藥學教研室楊秀娟副教授鑒定。奧沙利鉑購自山東羅欣藥業有限公司，批號：519121041。

1.1.3 試劑 RPMI1640培養液（美國Gibco公司，批號：11835-030）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：11012-8611）；4%多聚甲醛、HE試劑、檸檬酸（pH=6.0）抗原修復液、組化試劑盒DAB顯色液（Servicebio公司，批號：P1101、G1004、G1202、G1211）；Trizol總RNA提取試劑盒、第一鏈互補DNA（cDNA）Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR mix（德國Qiagen公司，批號：74256、205824、3306-11）；IL-6、IL-17 ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：MM-0163-M1、MM-017M2）；IL-6、IL-17、NF-κB p65、pNF-κB p65抗體（Gene Tex公司，批號：GTX110527；Servicebio公司，批號：GB11110；Immunoway公司，批號：YT3107；Gene Tex公司，批號：GTX133899）。

1.1.4 儀器 無菌超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；CO2恒溫培養箱（日本SANYO）；倒置相差顯微鏡、光學顯微鏡（日本Olympus）；IMark酶標分析儀、垂直電泳槽、電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad）；電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；脫水機（日本DIAPATH）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及胃癌荷瘤小鼠模型構建 胃癌細胞MFC用含10%胎牛血清、1%雙抗溶液的RPMI1640培養液于37 ℃、5%CO2下培養，培養至對數生長期調整密度為1×107個/ml，將0.2 ml細胞懸液接種于每只小鼠右腋下，接種5～7 d可觸及結節且直徑長至5 mm時造模成功。

1.2.2 動物分組及給藥 將造模成功的胃癌荷瘤小鼠按隨機數表法分為模型組、奧沙利鉑組、大補脾湯高、中、低劑量加奧沙利鉑組（簡稱聯合用藥高、中、低劑量組），每組10只，雌雄分籠飼養。根據小鼠和人體表面積比值0.002 6計算小鼠給藥劑量，奧沙利鉑為10 mg/kg，大補脾湯高、中、低劑量分別為21.58、10.79、5.40 g/kg，給藥量為0.2 ml，周期14 d。另隨機選取10只昆明小鼠作為空白組，空白組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水。

1.2.3 測定抑瘤率 最后1次給藥后24 h從小鼠眼球取血，離心分離血清冷凍備用。頸椎脫臼法處死小鼠，完全剝離皮下移植瘤，稱重并記錄。抑瘤率（%）=（模型組總平均瘤重-藥物組總平均瘤重）/模型組總平均瘤重×100%。

1.2.4 ELISA檢測血清IL-17、IL-6含量 各組小鼠取血，分離血清，-80 ℃保存，按ELISA試劑盒說明檢測血清IL-17、IL-6水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測各組小鼠腫瘤組織IL-17和NF-κB p65mRNA表達 Trizol法從合適的腫瘤組織中提取總RNA，逆轉錄為cDNA，按照熒光實時定量PCR試劑盒制備反應體系測定基因表達，反應要求為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環，繪制熔解曲線，基于各組Ct值，通過內參數值和目的基因數值計算ΔCt和ΔΔCt，最終得出2-ΔΔCt，即各組IL-17、NF-κB p65mRNA相對表達。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR

1.2.6 免疫組化檢測各組小鼠腫瘤組織IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表達 腫瘤組織石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中脫蠟15 min，梯度乙醇脫水，蒸餾水漂洗，置于檸檬酸抗原修復緩沖液高壓抗原修復，PBS沖洗3次；3%過氧化氫溶液中室溫避光孵育25 min，PBS沖洗3次，室溫密封30 min；加入IL-17、IL-6和NF-κB p65抗體稀釋液（1∶800），濕盒內4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶200）室溫搖床孵育50 min，DAB顯色，復染細胞核，脫水封片，顯微鏡下觀察顏色變化，圖像分析系統20倍物鏡下，每張切片隨機選取5個視野，測定腫瘤組織內IL-17、IL-6和NF-κB p65表達顆粒積分光密度，取平均值作為該只小鼠腫瘤組織IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表達。

1.2.7 Western blot檢測各組小鼠腫瘤組織IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表達 從適當大小腫瘤組織中提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性5 min，-20 ℃儲存，SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TIL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65一抗稀釋液（1∶1 000稀釋） 4 ℃冷藏過夜，TBST洗3次，加入二抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育2 h，ECL曝光，Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，與內參進行比較，分析蛋白相對表達。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件分析數據，計量資料以表示，組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠抑瘤作用的影響與模型組相比，各給藥組小鼠瘤重顯著減輕（P＜0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯合用藥高、中劑量組差異顯著（P＜0.01）。奧沙利鉑組和聯合用藥高、中、低劑量組抑瘤率分別為33.02%、52.92%、46.33%、39.52%（表2）。

表2 大補脾湯對各組胃癌荷瘤小鼠瘤體質量及抑瘤率的影響（，n=10）Tab.2 Effect of Dabupi Decoction on tumor weight and tumor inhibition rate of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

表2 大補脾湯對各組胃癌荷瘤小鼠瘤體質量及抑瘤率的影響（，n=10）Tab.2 Effect of Dabupi Decoction on tumor weight and tumor inhibition rate of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 2）P＜0.01.

Tumor inhibition rate/%-33.02 52.92 46.33 39.52 Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose Tumor weight/g 1.28±0.09 0.86±0.061）0.60±0.031）2）0.69±0.051）2）0.78±0.051）

2.2 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠血清IL-17和IL-6含量的影響 與空白組相比，模型組血清IL-17和IL-6含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組血清IL-17和IL-6含量顯著降低（P＜0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯合用藥高、中、低劑量組血清IL-17含量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），聯合用藥高、中劑量組血清IL-6表達下降（P＜0.01，P＜0.05），聯合用藥低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表3 大補脾湯對各組胃癌荷瘤小鼠血清IL-17和IL-6含量的影響（，n=10，pg/ml）Tab.3 Effect of Dabupi Decoction on serum concentrations of IL-17 and IL-6 of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10，pg/ml）

表3 大補脾湯對各組胃癌荷瘤小鼠血清IL-17和IL-6含量的影響（，n=10，pg/ml）Tab.3 Effect of Dabupi Decoction on serum concentrations of IL-17 and IL-6 of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.01；compared with model group， 2）P＜0.01；compared with oxaliplatin group， 3）P＜0.05，4）P＜0.01.

IL-6 64.14±4.47 114.41±8.221）92.99±6.762）73.37±6.602）4）82.19±3.832）3）84.43±6.292）Groups Control Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-17 50.62±2.95 99.59±6.841）79.32±5.032）56.17±5.862）4）63.60±3.982）4）70.49±4.632）3）

2.3 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-17和NF-κB p65mRNA表達的影響 與模型組相比，各給藥組IL-17和NF-κB p65mRNA表達顯著下降（P＜0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯合用藥高、中劑量組IL-17和NF-κB p65mRNA表達顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），聯合用藥低劑量組IL-17和NF-κB p65mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05，表4）。

表4 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-17和NF-κB p65 mRNA表達的影響（，n=10）Tab.4 Effect of Dabupi Decoction on IL-17 and NF-κB p65 mRNA expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

表4 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-17和NF-κB p65 mRNA表達的影響（，n=10）Tab.4 Effect of Dabupi Decoction on IL-17 and NF-κB p65 mRNA expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

Note：Compared with model group，1）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 2）P＜0.05， 3）P＜0.01.

NF-κB p65 1.00±0.00 0.84±0.021）0.63±0.051）3）0.75±0.011）2）0.78±0.031）Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-17 1.00±0.00 0.60±0.051）0.40±0.031）3）0.51±0.021）3）0.56±0.011）

2.4 免疫組化法檢測胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-17、IL-6和NF-κB p65定位和蛋白定量 蛋白陽性表達顯示為細胞核或細胞質出現棕黃色或棕色顆粒。與模型組相比，各給藥組IL-6、IL-17和NF-κB p65蛋白表達顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）；與奧沙利鉑組相比，聯合用藥高劑量組IL-6、IL-17和NF-κB p65蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），聯合用藥中劑量組NF-κB p65蛋白表達顯著下降（P＜0.01，圖1、表5）。

圖1 IHC檢測各組IL-17、IL-6和NF-κB表達（×200）Fig.1 IL-17， IL-6 and NF-κB expressions in each group detected by IHC （×200）

表5 大補脾湯對各組胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表達的影響（，n=10）Tab.5 Effect of Dabupi Decoction on IL-17， IL-6 and NF-κB p65 protein expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

表5 大補脾湯對各組胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-17、IL-6和NF-κB p65蛋白表達的影響（，n=10）Tab.5 Effect of Dabupi Decoction on IL-17， IL-6 and NF-κB p65 protein expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice in each group （，n=10）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-17 0.46±0.09 0.36±0.021）0.27±0.062）3）IL-6 0.42±0.07 0.35±0.082）0.24±0.042）3）NF-κB p65 0.55±0.04 0.42±0.052）0.28±0.032）4）0.30±0.022）0.29±0.042）0.35±0.022）3）0.32±0.032）0.30±0.022）0.39±0.032）

2.5 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織中IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表達的影響 與模型組相比，各給藥組IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表達顯著下降（P＜0.01）；與奧沙利鉑組相比，聯合用藥高劑量組IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01），聯合用藥中、低劑量組IL-6和pNF-κB p65蛋白表達下降（P＜0.05，P＜0.01），NF-κB p65蛋白表達差異無統計學意義（圖2、表6）。

圖2 Western blot檢測各組胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白表達Fig.2 IL-6， NF-κB p65 and pNF-κB p65 protein expressions in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice in each group detected by Western blot

表6 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白含量的影響（，n=10）Tab.6 Effect of Dabupi Decoction on IL-6， NF-κB p65 and pNF-κB p65 protein contents in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

表6 大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠腫瘤組織IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65蛋白含量的影響（，n=10）Tab.6 Effect of Dabupi Decoction on IL-6， NF-κB p65 and pNF-κB p65 protein contents in tumor tissues of gastric cancer-bearing mice （，n=10）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01； compared with oxaliplatin group， 2）P＜0.05， 3）P＜0.01.

Groups Model Oxaliplatin Combination high-dose Combination medium-dose Combination low-dose IL-6/GAPDH 1.32±0.01 1.05±0.041）0.76±0.041）3）NF-κB p65/GAPDH 1.29±0.01 1.02±0.011）0.75±0.021）3）pNF-κB p65/GAPDH 1.42±0.05 0.91±0.051）0.61±0.041）3）0.90±0.071）3）0.93±0.071）0.67±0.021）3）0.93±0.071）2）0.96±0.061）0.80±0.051）2）

3 討論

在祖國醫學中，胃癌歸屬于“噎膈”“胃脘痛”等范疇，近代醫家總結胃癌病因病機，病因可分為風寒濕等六淫邪毒外因和飲食不節、正氣內虛等內因，相互作用可導致脾胃臟腑功能失調，使氣滯、血瘀、痰結、熱毒等久稽于胃，導致癌腫［4］；病機主要包括瘀血內阻、癌毒蘊胃、氣滯痰凝、氣血不足等［5-8］。針對其氣血不足的病機，本研究選用敦煌醫方大補脾湯發揮補虛扶正、化生氣血功效。李應存教授臨床運用大補脾湯治療慢性萎縮性胃炎療效顯著［9］。大補脾湯是敦煌醫理類著作《輔行訣臟腑用藥法藥》中的方劑之一，原方“大補脾湯。治脾氣大疲，飲食不化，嘔吐下利，其人枯瘦如柴，立不可動轉，口中苦干渴，汗出，氣急，脈微而時結者方。人參、甘草炙，各三兩，干姜三兩，白術、麥門冬、五味子旋覆花一方作牡丹皮，當從。各一兩。右七位，以水一升，煮取四升，溫分四服，日三，夜一服”［10］。從全方看人參大補元氣，健脾化濕兼滋陰固腎，使正氣復而邪氣自除，方中重用人參、炙甘草為君藥，大補元氣，健脾復脈；干姜可入脾胃經，溫中散寒；白術、麥冬益胃生津；五味子可入腎經，益氣生津，滋腎固精；旋覆花可入肝、胃經，消痞止嘔，善降胃氣。

炎癥作為腫瘤十大生物學特點之一，在腫瘤發生中起重要作用。炎癥能夠促進癌癥發生和進展，炎癥介質可釋放一系列炎癥細胞因子，從而誘發連續炎癥反應，促進腫瘤細胞生長、轉移等，抑制免疫系統［11］。IL-17/NF-κB信號通路作為一條重要的炎癥信號通路，對機體炎癥反應、細胞凋亡等病理過程起重要作用，可參與胃癌的發生發展。IL-17是高度通用的促炎細胞因子，對炎癥性疾病發病機制和癌癥進展等至關重要。IL-17/IL-17R主要通過活化NF-κB信號轉導通路發揮作用，機體受到炎癥刺激時，IL-17與細胞表面的IL-17受體特異性結合，通過一系列翻譯修飾后的NF-κB活化并入核，發揮相應生物學效應［12］。NF-κB作為一種轉錄因子復合物，被上游激活后調節下游炎癥反應信號通路相關基因IL-6、IL-10及TNF-α等表達［13］。IL-6作為下游與IL-6受體結合后，通過激活下游信號轉導途徑，從而促進腫瘤發生發展［14］。牟曉映等［15］發現胃癌患者血液中Th17、IL-17和IL-6高表達，患者機體免疫功能紊亂，可能促進胃癌發生發展。

本研究通過稱取腫瘤重量計算抑瘤率研究大補脾湯聯合奧沙利鉑對胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用，發現與模型組相比，各給藥組抑瘤率升高而腫瘤重量降低，大補脾湯高、中劑量聯合奧沙利鉑組效果均顯著優于奧沙利鉑組。大補脾湯在抑制腫瘤生長方面發揮其大補元氣、增效減毒功效，且全方標本兼顧，抑瘤作用顯著。本研究基于IL-17/NF-κB通路探討大補脾湯對胃癌荷瘤小鼠炎癥免疫的作用機制，ELISA、免疫組化、Western blot、RT-qPCR分別檢測血清IL-17和IL-6及腫瘤組織IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA和蛋白表達，結果表明大補脾湯聯合用藥組IL-17、IL-6、NF-κB p65和pNF-κB p65 mRNA及蛋白較模型組均顯著下降，提示大補脾湯可能通過抑制IL-17/NF-κB信號通路關鍵分子mRNA和蛋白表達調控炎癥免疫，抑制胃癌發生發展。

綜上，敦煌醫方大補脾湯對MFC胃癌荷瘤小鼠具有一定抑瘤作用，可能通過抑制IL-17/NF-κB信號通路調控炎癥免疫，抑制胃癌發生發展。