基因編輯技術在視神經再生修復中的應用

隗雨 馬瓊 王常科 梁玉玲 康宏向

收稿日期：2023-06-29 ；修回日期：2023-08-22。

基金項目：國家自然科學基金項目（81901907）。

作者簡介：隗雨，碩士研究生。

* 通信作者：康宏向，副研究員，主要從事激光生物學研究。E-mail： khx007@163.com。

摘 要：視網膜極易因激光意外事故、中樞神經或視網膜退行性疾病發生異常改變，嚴重威脅視功能。目前，仍沒有針對哺乳動物視網膜損傷的完善修復機制。視網膜“干細胞”穆勒膠質（MG）細胞不能自發進入細胞周期，基因編輯手段可使MG細胞轉分化，從而具有視網膜祖細胞的能力。轉分化相關信號通路及調控因子對MG基因組重編程至關重要。基因編輯治療利用腺病毒、慢病毒等載體將外源基因導入體內，促使哺乳動物受損視網膜中MG細胞激增和去分化，損傷的視網膜神經元再生。與傳統藥物治療需要長期服藥相比，基因療法的出現有望實現通過一次治療達到修復目的。文章就視網膜修復機制、調控視神經再生的信號通路以及基因治療修復損傷視網膜研究現狀和應用過程中存在的問題進行綜述，并展望未來相關的發展趨勢。未來基因編輯治療將會給視神經再生修復研究帶來深刻變革，為視網膜疾病的治療帶來新的曙光。

關鍵詞：視網膜損傷修復；視神經再生；視網膜祖細胞；基因治療；基因編輯技術

中圖分類號：Q81? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.004

Advances in Optic Nerve Regenerative Repair Signaling Pathways and Gene Editing Therapeutics

WEI Yu1， 2， MA Qiong2， WANG Changke2， 3， LIANG Yuling1， KANG Hongxiang2*

（1. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071000; 2. Institute of Radiation Medicine， Academy of Milltary Medicine， Academy of Milltary Sciences， Beijing 100850， China; 3. College of Information Engineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， China）

Abstract： The retina is highly susceptible to abnormal changes due to laser accidents， central nervous system or retinal degenerative diseases， which can seriously threaten visual function. There is still no well-developed repair mechanism for mammalian retinal damage， and MG cells， the “stem cells” of the retina， cannot enter the cell cycle spontaneously， and MG cell transdifferentiation-related signalling pathways and regulatory factors play a crucial role in reprogramming the MG genome. Gene editing treatment of the retina enables the production of large numbers of neurons from MG cells in the damaged mammalian retina， replenishing damaged neurons and restoring vision. Gene editing therapy uses vectors such as adenovirus and lentivirus to introduce exogenous genes into the body to regenerate damaged retinal neurons. The advent of gene therapy holds the promise of achieving repair in a single treatment， as opposed to traditional drug treatments that require long-term medication. This article reviews the current status and problems in the application of gene therapy for retinal repair， the signalling pathways regulating optic nerve regeneration， and the future trends of gene therapy for retinal repair. In the future， gene editing therapy will bring profound changes to the research of optic nerve regeneration and repair， and bring a new dawn to the treatment of retinal diseases.

Key words： retinal damage repair; optic nerve regeneration; retinal progenitor cells；gene therapy; gene editing technology

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（5）： 414-422）

目前已有研究證實，阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）、帕金森病（Parkinsons disease，PD）、多系統萎縮（multiple system atrophy，MSA）等中樞神經退行性病變均可發生視網膜異常改變［1］。視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）、年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）、糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）和黃斑營養不良癥（stargardt disease，STGD）等視網膜退行性疾病［2-4］以及激光眼損傷意外事故均能導致視網膜的結構和功能發生變化，且主要表現為生物大分子如蛋白質、核酸變性、鈣離子過載，從而致使神經細胞發生死亡。另外，色素上皮細胞凋亡、光感受器改變和視網膜過氧化反應增強，從而產生了過多自由基，導致視網膜進一步損傷。DR是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，血管增生引發的炎癥反應、氧化應激、血管內皮細胞和神經節細胞的凋亡等都參與到糖尿病視網膜病變的發病進程中，導致視力受損甚至失明［5］。其發病機理尚未完全闡明，出現視力受損時已經失去最佳治療時機［6-7］，目前臨床上缺乏有效逆轉恢復患者視力的治療手段。PD作為第二大常見于中老年的中樞神經系統退行性疾病，視覺障礙是PD患者非運動癥狀之一，包括顏色辨別、視敏度、對比度和視力的喪失等［8-9］。目前，隨著病程和治療時間延長，臨床上藥物治療難以改善甚至會加重患者的非運動癥狀［10-11］。

1 視網膜修復機制及治療技術概況

硬骨魚（如斑馬魚）等脊椎動物的視網膜中存在一種視網膜損傷后自我修復機制，其中穆勒膠質（Müller glial，MG）細胞起主導作用。斑馬魚視網膜中的MG細胞通過重新進入細胞周期發生去分化，改變其形態、生化結構和生理特性，對視網膜損傷作出反應，MG細胞的這些變化被稱為反應性膠質增生［12-14］ 。但長期的膠質增生會導致細胞團沉積而阻礙正常神經功能［15］。MG細胞去分化具有視網膜祖細胞的能力，進而增殖分化成為所有主要類型的視網膜細胞來補充受損神經元，最終恢復視力。有研究發現，原雞屬原雞種家禽（Gallus gallus）剛出生時，視網膜MG細胞受損傷后發生反應性膠質增生，但是僅有一小部分MG細胞去分化為視網膜祖細胞，而成年鳥類視網膜受損情況下MG細胞不具有再生能力［16-19］。哺乳動物沒有完善的視網膜損傷修復機制，其MG細胞不能自發進入細胞周期，在視網膜損傷的情況下僅有少量MG細胞增殖并引起神經再生 ［20］。

傳統的視網膜損傷治療技術包括中醫藥、神經細胞保護劑和糖皮質激素類藥物等［21-25］。中藥方劑四妙勇安湯加味益氣活血方（黃芪、當歸、紅花等）、血通絡利水合劑等對激光引發的視網膜損傷有一定的保護作用［26-27］；激素類曲安奈德被廣泛應用于治療視網膜損傷，多用于修復視網膜退行性疾病引起的視力受損，可在早期有效干預激光兔眼損傷［28］；二甲基硫脲作為一種特異的自由基清除劑，可有效地抑制感光細胞脂質過氧化，從而保護視網膜結構和形態。然而，無論是中藥、糖皮質激素還是神經保護劑，均僅僅緩解了視網膜的繼發性損傷，并不能直接修復受損或缺失的神經細胞以恢復視力，未能從根本上解決問題。因此，尋找更好的治療視網膜疾病的方法至關重要。

隨著眼損傷機理研究不斷深入，目前針對視網膜損傷治療出現了一些新型治療技術，主要有視覺假體、細胞移植和基因水平治療等［29-33］。Eggenberger等［34］開發出一款“Phoenix99”仿生眼，將刺激電極陣列植入于大腦視皮層，假體電極通過繞過大部分視覺傳導通路直接刺激視皮層處的視覺中樞，使假體植入者感知到閃爍光點。這作為一種視力恢復潛在方法仍存在很大的限制：植入假體的安全性、穩定性和有效性均存在不足，也不適合治療DR、青光眼或外傷等光感受器缺失而導致的失明。干細胞可以定向誘導分化成視網膜神經元，促使視網膜功能恢復。胚胎干細胞、誘導多功能干細胞來源的各種視網膜細胞具有部分再生、并挽救視功能的能力。2012年，美國先進細胞公司首次開展了人胚胎干細胞來源的視網膜色素上皮細胞移植治療AMD和青少年黃斑變性的臨床試驗，初步證明了干細胞治療視網膜疾病的安全性［35］。隨著分子技術的不斷進步，視網膜損傷基因水平治療發展迅速，成為一種非常有前景的治療方法。它主要是通過對相關基因重新編程來推動損傷視網膜的修復，同時可利用各種非侵入性檢查手段判斷視網膜內轉基因的表達和治療效果［36］。通過基因編輯有望實現哺乳動物視網膜MG細胞再分化，為今后視網膜損傷治療提供了很好的治療策略。

2 調控視神經再生的信號通路

MG細胞是一種星形膠質細胞，幾乎貫穿整個視網膜層，其主要功能就是維持視網膜的完整和穩定，是視網膜損傷后新生神經元的主要來源。另外，無長突細胞、小膠質細胞和內皮細胞也是新生神經元來源［37-39］。隨著MG細胞的功能被逐步發掘，與MG細胞轉分化相關的信號通路以及調控因子也得到了進一步研究。研究表明，Wnt、MAPK、North、Jak-Stat以及相關生長因子和基因對MG基因組重編程至關重要（圖1），視網膜祖細胞分化機制對成年哺乳動物視網膜損傷修復具有重要意義［40-53］。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路

MG細胞增殖與典型Wnt/β-catenin信號通路有關，Wnt信號促使β-catenin穩定表達，誘導MG衍生的視網膜祖細胞增殖［40］。β-catenin是一種多功能蛋白，是檢測Wnt是否激活的一個重要標志。接受Wnt信號刺激時，β-catenin啟動下游靶基因轉錄；相反，未接受Wnt信號刺激時，糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，Gsk3β）形成毀滅復合體，Wnt信號通路不被激活，從而抑制衍生的祖細胞增殖［41］。此外，轉錄因子Ascl1在斑馬魚未受損視網膜中可刺激MG衍生祖細胞增殖，而在受損視網膜中，Ascl1通過上調Wnt受體Wnt4a的水平促進Wnt信號表達，進而刺激MG細胞產生表達祖細胞特有基因的新生神經元。這進一步證實了Wnt信號對MG細胞的調控至關重要。另外，在N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid ，NMDA）損傷后的嚙齒動物視網膜中，Wnt信號傳導也被證明可以調控MG細胞的增殖和新興神經元的產生［42］。

2.2 MAPK信號通路

MAPK信號通路影響視網膜再生。未受損視網膜中肝素結合性表皮生長因子 （heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）能夠刺激MG細胞向祖細胞分化。同時，在損傷視網膜中，HB-EGF/EGFR/MAPK 信號級聯通過影響Ascl1a 和配對框基因6（paired box gene 6，Pax6）的表達來控制 MG 去分化和視網膜再生［43］；HB-EGF/EGFR/MAPK/Ascl1a信號也可激活Notch信號，Ascl1a能夠調控Notch 信號表達，而Notch信號又能夠反抑制Ascl1a表達。由此表明，HB-EGF/Ascl1a/Notch信號通路循環既能夠誘導MG細胞對視網膜損傷的反應又可以幫助去分化MG細胞定位在受損傷部位。另有研究發現，眼內注射多肽激素睫狀神經營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF ）可以抑制光感受器細胞死亡，并能夠抑制MAPK 信號通路，顯著降低CNTF的神經保護作用［44-45］。綜上所述，Notch信號是MAPK信號的下游，并且是MAPK信號驅動MG增殖所必需的，這說明發育的神經系統中Notch 和MAPK存在相互作用。

2.3 Notch信號通路

大多數未受損MG細胞中的Notch通路組成部分呈現低水平表達，可以降低神經發生過程中膠質細胞的神經保護活性。Notch信號通路在未受損的小雞視網膜中起著重要的作用，它可使祖細胞維持在原始狀態并促進神經細胞存活，而NMDA損傷的雞視網膜，其MG細胞衍生神經元過程中Notch信號增強［46］。使用γ-分泌蛋白抑制劑DAPT，雖然影響了Notch 信號通路的一些成分，但膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）沒有明顯的變化，而GFAP在活躍的MG中上調，說明Notch信號通路并不影響膠質細胞的活躍［47］。Campbell等［48］通過敲低斑馬魚Delta配體和Notch3受體，發現DeltaB和Notch3在視網膜增殖細胞中表達增加，Notch3和DeltaB介導斑馬魚視網膜再生中MG細胞增殖的負調節。

綜上所述，Notch 信號通路在損傷視網膜MG細胞的增殖過程中發揮了重要作用。

2.4 Jak-Stat信號通路

相對于其他通路，Jak/Stat通路構成簡單。Jak蛋白在CNTF作用下與Stat蛋白結合［49］，刺激視網膜MG細胞中Stat3表達，而Stat3敲除能夠抑制祖細胞生成，說明CNTF能夠通過Jak-Stat信號通路誘導MG細胞和神經祖細胞增殖［50］。激光損傷視網膜中Stat3的活化受到Ascl1表達調控，Stat3敲除能夠減少Ascl1表達，而Ascl1敲除能夠抑制Stat3表達，減少重新進入細胞周期的MG細胞［51］。

2.5 調控MG細胞再生的相關基因

八聚體結合轉錄因子4（octamer binding transcription factor 4，Oct4），又稱Pou5F3，是一種重要的多能性誘導因子，它可通過調節幾種再生相關因子如Ascl1a、Lin28a、Sox2、Zeb、E-cadherin 和各種miRNA如let-7a、miR-200a/miR200b、miR-143/miR-145等調控MG細胞增殖分化［52］，故在視網膜再生過程中發揮重要作用。Pax6在視網膜再生過程中起著重要作用，在Ascl1調控下Pax6能促進視網膜損傷后MG 細胞增殖和分化為具有祖細胞特征的細胞［53］。

3 視神經再生修復的基因編輯治療技術

傳統治療方法不能解決視網膜損傷的根本問題，即光感受器的損傷。干細胞移植雖然能直接補充缺失的神經細胞，但仍存在著各種缺陷，如移植細胞生存、遷移以及如何與受體建立突觸連接，倫理學問題及取材問題都深深桎梏著干細胞治療的應用與發展［54］。隨著研究不斷深入，基因編輯技術治療視網膜得到了大量的研究和關注，使用基因編輯方法既能修復受損的光感受器細胞，又能克服干細胞移植存在的系列問題。損傷視網膜的基因編輯治療與脊椎動物視網膜“干細胞”MG細胞密切相關，基因編輯治療使哺乳動物受損視網膜中MG細胞激增，去分化后補充受損神經元并恢復視力。哺乳動物MG細胞轉分化過程如圖2所示，通過對MG細胞重編程，使其能夠對視網膜損傷做出反應，從而使它們能夠獲得視網膜祖細胞具有的可以分化產生多種神經元的能力。增殖產生的原始MG細胞遷移到所有細胞層，隨后退出細胞周期并再生為所有主要視網膜細胞類型。

3.1 基因編輯技術

基因編輯是一種比較精確的生物體基因組特定目標修飾方法。最早的基因編輯技術為同源重組，通過將外源DNA導入受體細胞以促使特定基因失活或修復［55］。隨著對基因編輯技術的不斷探索，基因工程載體的應用可實現精準高效地基因改造，其在治療遺傳性眼科疾病方面也存在巨大的潛力。

基因重組介導的位點特異性重組被廣泛應用于基因功能研究，技術核心是位點特異性重組酶系統。目前應用較多的為酪氨酸重組酶，主要包括Cre（causes recombination）重組酶和Dre重組酶［56-58］。Cre 重組酶系統主要由Cre重組酶和Loxp［locus of crossing over（x） P1］序列兩個部分組成。Cre 重組酶能特異性識別Loxp 序列并介導該序列間DNA 發生刪除、倒位和易位。Dre重組酶可特異性識別Rox位點，介導該位點間的DNA序列發生重組。Dre重組酶和Cre重組酶作用機制類似，但相互不發生交叉反應，通過基因工程載體使二者聯用可實現更精確的基因操作［59-60］。CRISPR/Cas9 系統的出現進一步拓寬了酪氨酸重組酶的使用范圍，利用該系統介導的同源重組極大地提高了識別位點的整合效率。CRISPR-Cas9基因編輯技術通過人工設計的向導RNA分子（guide RNA，sgRNA）來識別目的基因組序列。這是由于sgRNA分子含有與靶DNA序列互補的序列（PAM序列），能夠引導DNA內切酶Cas9 蛋白酶對特定位點進行有效切割DNA 雙鏈，形成雙鏈DNA斷裂，然后細胞會借助同源重組機制或者非同源末端連接機制對斷裂的DNA進行修復進而造成基因敲除或敲入，最終達到對基因組DNA修飾的目的（圖3）。CRISPR-Cas9基因組編輯技術給分子生物學領域帶來了一場變革，只需使用細菌核酸酶Cas9和引導酶切位點的短RNA，就能夠在活體生物中有效敲除或者改變基因序列，這為許多疾病的治療帶來了新希望。美國國立衛生研究院眼科研究所基于Cre重組系統，通過病毒載體直接向視網膜輸送基于CRISPR-Cas9的治療元件，成功在視網膜變性小鼠中阻止了視網膜色素變性［61］。薛天團隊和仇子龍團隊合作，結合視覺神經生物醫學與創新CRISPR/Cas9基因編輯技術，首次通過同源重組修復方法在小鼠視網膜感光細胞中實現精準基因修復，使視網膜色素變性小鼠重獲部分視覺功能［62］。

3.2?基于基因編輯技術的視神經再生修復研究

眼球獨特的生理結構使基因編輯療法在眼科疾病的應用上具有先天的優勢。首先，眼球體積較小，需要的治療載體較少；其次，眼部區域具有免疫赦免，這既可避免外源性物質引起的炎癥和免疫反應，也有利于基因編輯載體維持其活性；再次，慢病毒和腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）等載體介導的眼科疾病基因療法，不會引起全身性反應；最后，多種嚴重眼科疾病與基因突變密切相關。因此，這些特點使眼科疾病對基因編輯療法有著強烈的需求，也為其在眼科疾病治療中的率先應用創造了條件。

3.2.1 視網膜損傷的視神經再生修復研究

Ooto等［63］將NMDA注入成年大鼠玻璃體造成視網膜損傷，經免疫熒光檢測發現，部分MG細胞受到刺激發生增殖并產生有限的雙極細胞和視桿細胞。他們的研究發現：NMDA損傷后2 d，使用維甲酸能夠有效提高雙極細胞再生數量；進一步使用復制能力不強的逆轉錄病毒指導GFP的表達，在NMDA處理的視網膜中錯誤表達內源基因螺旋-環-螺旋基因Math3、NeuroD 和同源盒基因Pax6、Crx會促進無長突特異性表型的誘導；同時，NeuroD 和Crx 共表達促進光感受器特異性表型的誘導。這表明哺乳動物受損視網膜神經元可以再生。

Karl等［64］研究發現，眼內注射NMDA并通過特定生長因子刺激能使MG細胞重新進入有絲分裂周期，從而在體內產生小鼠視網膜神經元。成年小鼠NMDA注射造成視網膜損傷后進行表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）或纖維細胞生長因子（recombinant fibroblast growth factor 1，FGF1）與胰島素聯合眼內注射治療，溴脫氧尿苷（bromodeoxyuridine，BrdU）染色結果顯示，在未受損視網膜中注射EGF的動物有很少量BrdU細胞存在，但NMDA誘導損傷后接受EGF的動物有大量BrdU細胞存在，說明后者有大量細胞進入了細胞周期；為進一步證實NMDA損傷的視網膜中產生了新神經元，對GAD67-GFP轉基因重組小鼠多次注射FGF1/胰島素，結果顯示，MG細胞的大多數后代保持其MG細胞標記物的表達，但少數BrdU標記的細胞分化為無長突細胞并特異性表達無長突細胞標志物NeuN、Calretinin、Pax6和GAD67-GFP，表明哺乳動物視網膜具有在體內再生視網膜內部神經元的潛力。

Jorstad 等［65］研究發現，NMDA損傷視網膜后，通過使用具有MG特異性啟動子的他莫西芬系統誘導的Cre重組酶小鼠，促使Ascl1在MG細胞中特異性過表達，進一步使MG細胞分化為視網膜神經元。NMDA損傷前向玻璃體內注射他莫西芬，以激活驅動Ascl1基因的四環素應答元件，隨后給予組蛋白脫乙酰酶抑制劑曲霉菌素A（TSA）。結果表明，Ascl1過表達與TSA共同使用促使成年小鼠損傷視網膜MG細胞產生新興神經元，新生成的視網膜神經元與宿主電路形成突觸連接，并與宿主神經元形成功能連接，最終對光做出反應。這有效證明TSA促進了MG細胞的染色質可及性，使MG細胞更有效重新編程，這為治療致盲性視網膜疾病提供了一種新的方法。

3.2.2 視網膜未損傷的視神經再生修復研究

2018年，Yao等［66］采用兩步法即以病毒作為載體對MG細胞進行重編程，最終在哺乳動物中得到了MG細胞衍生的視桿細胞，并使受損的視力得到恢復（圖4）。首先，他們利用重組腺相關病毒將β-catenin于玻璃體注入小鼠視網膜內，促進未損傷視網膜MG細胞增殖并重新進入細胞循環，進而再次獲得分化能力；隨后，導入決定視桿細胞命運的轉錄因子Otx2、Crx和Nrl，促進去分化的MG細胞再分化為視桿細胞，且通過電生理檢測證明新生視桿細胞具有原本視桿細胞功能；同時，通過熒光標記展示MG細胞向視桿細胞轉化過程，提出了令人信服的MG衍生再生改善哺乳動物視力的證據，證明了MG來源的神經發生在無需視網膜損傷的必要條件下能夠改善視力。

Tom Reh團隊在2017年研究中發現，Ascl1可以誘導小鼠視網膜MG細胞成為祖細胞，這些祖細胞又可以反過來分化為視網膜神經元，但誘導效率低下，僅能夠誘導30%的MG細胞成為神經元［67］；隨后在2021年研究中他們發現：通過病毒介導添加轉錄因子Atoh能夠有效促使祖細胞分化；進一步研究發現，通過將Ascl1與Atoh（被稱為Atoh1或Atoh7的兩種同源因子）聯合使用，即使在沒有視網膜損傷的情況下也能夠刺激神經發生，并證明這兩種轉錄因子的組合能夠產生多種視網膜神經元類型（其中大多數表達視網膜神經節細胞的特征）［68］。

2023年，徐穎研究員和陳功教授團隊報道，NeuroD1可使視網膜的多種神經元再生［69］。NeuroD1是一種神經轉錄因子，能夠在體內將腦星形膠質細胞重新編程為神經元。在成年小鼠中，NeuroD1可以重新編程MG細胞成為視網膜神經元。使用兩種血清型不同的AAV病毒載體過表達NeuroD1，從而將MG細胞轉化為不同的細胞類型。AAV7將MG細胞轉化為視網膜內部神經元，包括無細胞和神經節細胞。相比之下，AAV9將MG細胞轉化為視網膜外神經元，如光感受器和水平細胞，并具有更高的轉化效率。這些結果表明，成年小鼠中的MG細胞具有高度可塑性，可以重新編程為視網膜神經元的各種亞型。

4 總結與展望

視網膜的損傷大多數是以光感受器細胞進行性的、不可逆的損傷為特征，最終導致視力喪失，至今為止沒有明確的治療方法，不能很好地滿足對損傷視網膜治療的實際需求。各種治療方法的作用機理和不良反應還沒有得到進一步闡明，且目前多數損傷修復方法僅僅緩解損傷導致的組織過氧化和炎癥反應等視網膜繼發性損傷，并不能直接補充缺失的神經細胞。MG細胞可以在魚類和鳥類的視網膜損傷后增殖，并產生新的視網膜神經元新神經元，這為哺乳動物視網膜再生研究提供了一些證據。盡管受損細胞似乎啟動了MG細胞重編程和視網膜再生，但其他細胞類型是否參與尚不清楚，例如，小膠質細胞和免疫細胞。小膠質細胞在視網膜損傷后被激活并遷移到損傷部位［70］。將上述損傷反應與MG細胞的損傷反應進行比較可能會發現改善哺乳動物視網膜再生的新策略。MG細胞重編程是近些年來迅速發展的神經元修復方法，在此領域取得的一系列突破性進展正在改變人們的傳統觀念，并引發了人們對神經系統再生的重新認識。最新的研究表明，通過對小鼠視網膜MG細胞重編程，可以實現視網膜在未受損情況下分化為新的視網膜神經元。MG細胞基因組的重編程使其增殖、分化為新型神經元，這個過程被多種通路和信號分子調控，不單單依靠某種通路和蛋白調控，更需要多種信號級聯控制，是一個非常龐大且復雜的系統。明確調控信號網絡能夠更好地認識視網膜MG細胞的轉分化過程，這將會給視網膜疾病的治療帶來新的曙光。

綜上所述，基因水平治療以其獨特優勢，在視神經損傷修復方面展現出非常重大的臨床應用價值，但目前大部分研究還處于實驗室階段，尚未形成系統性的基因治療方法，其治療有效性仍待進一步驗證。在MG細胞重編程有關機制機理、給藥方案以及治療效果的研究基礎上，下一步的研究工作重點在于優化基因編輯治療方法、提出系統化給藥方案以及提高其治療有效性，從多種水平進行試驗探究，并且進行更多的臨床試驗驗證，讓更多嘗試走出實驗室，使其在損傷修復中更加完善、實用，為后續研究打下堅實的基礎。

參考文獻（References）：

［1］ 白莉， 李淑華. 神經退行性疾病的視網膜改變研究［J］. 神經疾病與精神衛生， 2021， 21（10）： 685-689.

BAI Li， LI Shuhua. Study of retinal changes in neurodegenerative diseases［J］. Journal of Neuroscience and Mental Health， 2021， 21（10）： 685-689.

［2］ PEIXOTO R D S， KRSTIC L， HILL S C L， et al. Predicting quality of life in amd patients-insights on the new nice classification and on a bolt-on vision dimension for the eq-5d［J］. Eye， 2021， 35（12）： 3333-3341.

［3］ PEREIRA D M， SHAH A， DSOUZA M， et al. Quality of life in people with diabetic retinopathy： indian study［J］. Journal of Clinical and Diagnostic Research， 2017， 11（4）： Nc01-Nc06.

［4］ WAUGH N， LOVEMAN E， COLQUITT J， et al. Treatments for dry age-related macular degeneration and stargardt disease： a systematic review［J］. Health Technology Assessment， 2018， 22（27）： 1-168.

［5］ SABANAYAGAM C， BANU R， CHEE M L， et al. Incidence and progression of diabetic retinopathy： a systematic review［J］. The Lancet Diabetes & Endocrinology， 2019， 7（2）： 140-149.

［6］ 何潤西， 徐銘超， 黎曉冬， 等. 環狀RNA參與調控糖尿病視網膜病變的研究進展［J］. 國際眼科雜志， 2022， 22（1）： 49-52.

HE Runxi， XU Mingchao， LI Xiaodong， et al. Advances in the study of cyclic RNA involved in the regulation of diabetic retinopathy［J］. International Eye Science， 2022， 22（1）： 49-52.

［7］ 孫娟， 何紅. 糖尿病視網膜病變危險因素的研究進展［J］. 中華眼底病雜志， 2020， 36（12）： 986-990.

SUN Juan， HE Hong. Advances in the study of risk factors for diabetic retinopathy［J］. Chinese Journal of Ocular Fundus Diseases， 2020， 36（12）： 986-990.

［8］ ARCHIBALD N K， CLARKE M P， MOSIMANN U P， et al. The retina in Parkinsons disease［J］. Brain： A Journal of Neurology， 2009， 132（5）： 1128-1145.

［9］ BODIS-WOLLNER I. Retinopathy in Parkinson disease［J］. Journal of Neural Transmission， 2009， 116（11）： 1493-1501.

［10］ 李婭婭. 帕金森病患者視網膜改變的臨床研究［D］. 大連： 大連醫科大學， 2017： 990.

LI Yaya. Clinical study of retinal changes in patients with Parkinsons disease［D］. Dalian： Dalian Medical University， 2017： 990.

［11］ 梁奕柳. 帕金森病患者視網膜結構改變的臨床研究［D］. 福州： 福建醫科大學， 2018.

LIANG Yiliu. Clinical study of retinal changes in patients with Parkinsons disease［D］. Fuzhou： Fujian Medical University， 2018.

［12］ CAMERON D A， GENTILE K L， MIDDLETON F A， et al. Gene expression profiles of intact and regenerating zebrafish retina［J］. Molecular Vision， 2005， 11： 775-791.

［13］ FAILLACE M P， JULIAN D， KORENBROT J I. Mitotic activation of proliferative cells in the inner nuclear layer of the mature fish retina： regulatory signals and molecular markers［J］. Journal of Comparative Neurology， 2002， 451（2）： 127-141.

［14］ WU D M， SCHNEIDERMAN T， BURGETT J， et al. Cones regenerate from retinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina［J］. Investigative Ophthalmology & Visual science， 2001， 42（9）： 2115-2124.

［15］ BRINGMANN A， IANDIEV I， PANNICKE T， et al. Cellular signaling and factors involved in Müller cell gliosis： neuroprotective and detrimental effects［J］. Progress in Retinal and Eye Research， 2009， 28（6）： 423-451.

［16］ GHAI K， ZELINKA C， FISCHER A J. Notch signaling influences neuroprotective and proliferative properties of mature Müller glia［J］. Journal of Neuroscience， 2010， 30（8）： 3101-3112.

［17］ FISCHER A J， REH T A. Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina［J］. Nature Neuroscience， 2001， 4（3）： 247-252.

［18］ HAYES S， NELSON B R， BUCKINGHAM B， et al. Notch signaling regulates regeneration in the avian retina［J］. Developmental Biology， 2007， 312（1）： 300-311.

［19］ FISCHER A J. Neural regeneration in the chick retina［J］. Progress in Retinal and Eye Research， 2005， 24（2）： 161-182.

［20］ DYER M A， CEPKO C L. Control of Müller glial cell proliferation and activation following retinal injury［J］. Nature Neuroscience， 2000， 3（9）： 873-880.

［21］ 楊霞， 蔣鵬飛， 彭俊， 等. 蠐螬對激光損傷兔血-視網膜屏障后視網膜TekA、p75NTR表達的影響［J］. 中華中醫藥學刊， 2019， 37（10）： 2456-2460， 2576-2579.

YANG Xia， JIANG Pengfei， PENG Jun， et al. Effect of grubs on retinal TekA and p75NTR expression after laser-injured rabbit blood-retinal barrier［J］. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine， 2019， 37（10）： 2456-2460， 2576-2579.

［22］ 蔣鵬飛， 楊霞， 彭俊， 等. 蠐螬對激光損傷兔血-視網膜屏障后視網膜TekC、ngf表達的影響［J］. 世界科學技術-中醫藥現代化， 2019， 21（11）： 2508-2515.

JIANG Pengfei， YANG Xia， PENG Jun， et al. Effect of grubs on retinal tekc and ngf expression after laser injury to the blood-retinal barrier in rabbits ［J］. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine， 2019， 21（11）： 2508-2515.

［23］ 陳少軍， 陰正勤. RNA點印跡探測堿性成纖維細胞生長因子在激光損傷后視網膜中的表達［J］. 重慶醫學， 2002（12）： 1173-1174.

CHEN Shaojun， YIN Zhengqin. RNA dot blotting detects expression of basic fibroblast growth factor in the retina after laser injury［J］. Chongqing Medical， 2002（12）： 1173-1174.

［24］ 陳鵬， 單清， 張杰， 等. DMTU對激光視網膜損傷治療作用的實驗研究［J］. 激光技術， 2003（4）： 285-287.

CHEN Peng， SHAN Qing， ZHANG Jie， et al. Experimental study of the therapeutic effect of DMTU on laser retinal damage［J］. Laser Technology， 2003（4）： 285-287.

［25］ 路俊霞， 張妍. 抗血管內皮生長因子聯合糖皮質激素治療糖尿病黃斑水腫的療效分析［J］. 臨床內科雜志， 2020， 37（7）： 519-520.

LU Junxia， ZHANG Yan. Analysis of the efficacy of anti-vascular endothelial growth factor combined with glucocorticoids in the treatment of diabetic macular edema［J］. Journal of Clinical Internal Medicine， 2020， 37（7）： 519-520.

［26］ 宋陽光. 中藥聯合局部糖皮質激素治療黃斑水腫［J］. 醫學理論與實踐， 2016， 29（3）： 353-354.

SONG Yangguang. Traditional Chinese medicine combined with topical glucocorticoids for the treatment of macular edema［J］. Medical Theory and Practice， 2016， 29（3）： 353-354.

［27］ 李成臨. 四妙勇安湯加味對圍激光期糖尿病性視網膜病變治療作用的臨床觀察［D］. 濟南： 山東中醫藥大學， 2018.

LI Chenglin. Clinical observation on the therapeutic effect of Simiao Yongan Decoction on diabetic retinopathy in the peri-laser period［D］. Jinan： Shandong University of Traditional Chinese Medicine， 2018.

［28］ 江運長， 彭清華， 楊霞. 益氣活血法對兔視網膜激光損傷后bFGF和GFAP表達的影響［J］. 眼科新進展， 2011， 31（3）： 220-222， 227.

JIANG Yunchang， PENG Qinghua， YANG Xia. Effect of benefiting qi for activating blood circulation on the expression of bFGF and GFAP after laser injury in rabbit retina［J］. Recent Advances in Ophthalmology， 2011， 31（3）： 220-222， 227.

［29］ 陳松， 祃紅燕， 林錦鏞， 等. 曲安奈德對氪激光誘導的兔視網膜組織損傷的療效觀察［J］. 臨床眼科雜志， 2006（1）： 68-70.

CHEN Song， MA Hongyan， LIN Jinyong， et al. The efficacy of trimethoprim on krypton laser-induced retinal tissue damage in rabbits［J］. Journal of Clinical Ophthalmology， 2006（1）： 68-70.

［30］ 張杰. 骨髓間充質干細胞分化為視網膜結構及其在重度視網膜損傷中的治療作用［D］. 北京： 中國人民解放軍軍事醫學科學院， 2003.

ZHANG Jie. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into retinal structures and their therapeutic role in severe retinal injury［D］. Beijing： Chinese Peoples Liberation Army Academy of Military Medical Sciences， 2003.

［31］ PEARSON R A， BARBER A C， WEST E L， et al. Targeted disruption of outer limiting membrane junctional proteins （crb1 and zo-1） increases integration of transplanted photoreceptor precursors into the adult wild-type and degenerating retina［J］. Cell Transplant， 2010， 19（4）： 487-503.

［32］ BECK T， NUGLISCH J， SAUER D， et al. Effects of flunarizine on postischemic blood flow， energy metabolism and neuronal damage in the rat brain［J］. European Journal of Pharmacology， 1988， 158（3）： 271-274.

［33］ 黃志華， 李良東， 黎曉， 等.拳參正丁醇提取物對視網膜缺血再灌注損傷時一氧化氮及一氧化氮合酶的影響［J］. 時珍國醫國藥， 2010， 21（7）： 1591-1593.

HUANG Zhihua， LI Liangdong， LI Xiao， et al. Effect of PBNA on the NO content and NOS activity in ischemia/reperfusion injury in the rat retina ［J］. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research， 2010， 21（7）： 1591-1593.

［34］ EGGENBERGER S C， JAMES N L， HO C， et al. Implantation and long-term assessment of the stability and biocompatibility of a novel 98 channel suprachoroidal visual prosthesis in sheep［J］. Biomaterials， 2021， 279： 121191.

［35］ SCHWARTZ S D， HUBSCHMAN J P， HEILWELL G， et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration： a preliminary report［J］. Lancet （London， England）， 2012， 379（9817）： 713-720.

［36］ LEWIN A S， DRENSER K A， HAUSWIRTH W W， et al. Ribozyme rescue of photoreceptor cells in a transgenic rat model of autosomal dominant retinitis pigmentosa［J］. Nature Medicine， 1998， 4（8）： 967-971.

［37］ FRIEDLANDER M. Fibrosis and diseases of the eye［J］. Journal of Clinical Investigation， 2007， 117（3）： 576-586.

［38］ HANISCH U K， KETTENMANN H. Microglia： active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain［J］. Nature Neuroscience， 2007， 10（11）： 1387-1394.

［39］ INMAN D M， HORNER P J. Reactive nonproliferative gliosis predominates in a chronic mouse model of glaucoma［J］. Glia， 2007， 55（9）： 942-953.

［40］ RAMACHANDRAN R， ZHAO X F D. Ascl1a/dkk/β-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3β inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2011， 108（38）： 15858-15863.

［41］ MEYERS J R， HU L， MOSES A， et al. Β-catenin/Wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina［J］. Neural Development， 2012， 7（1）： 30.

［42］ OSAKADA F， OOTO S， AKAGI T， et al. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals［J］. Journal of Neuroscience， 2007， 27（15）： 4210-4219.

［43］ TODD L， VOLKOV L I， ZELINKA C， et al. Heparin-binding egf-like growth factor （HB-EGF） stimulates the proliferation of Müller glia-derived progenitor cells in avian and murine retinas［J］. Molecular and Cellular Neurosciences， 2015， 69： 54-64.

［44］ HILL CAROLINE S， TREISMAN R. Transcriptional regulation by extracellular signals： mechanisms and specificity［J］. Cell， 1995， 80（2）： 199-211.

［45］ MARSHALL CHRISTOPHER J. Map kinase kinase kinase， map kinase kinase and map kinase［J］. Current Opinion in Genetics & Development， 1994， 4（1）： 82-89.

［46］ NELSON C M， ACKERMAN K M， OHAYER P， et al. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration［J］. The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2013， 33（15）： 6524-6539.

［47］ CAMPBELL L J， HOBGOOD J S， JIA M， et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina［J］. Glia， 2021， 69（3）： 546-566.

［48］ CAMPBELL L J， LEVENDUSKY J L， STEINES S A， et al. Retinal regeneration requires dynamic notch signaling［J］. Neural Regeneration Research， 2022， 17（6）： 1199-1209.

［49］ LEVY D E， LEE C K. What does stat3 do？［J］. Journal of Clinical Investigation， 2002， 109（9）： 1143-1148.

［50］ NELSON C M， GORSUCH R A， BAILEY T J， et al. Stat3 defines three populations of Müller glia and is required for initiating maximal Müller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina［J］. The Journal of Comparative Neurology， 2012， 520（18）： 4294-4311.

［51］ ZHAO X F， WAN J， POWELL C， et al. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Müller glia reprogramming and retina regeneration［J］. Cell Reports， 2014， 9（1）： 272-284.

［52］ SHARMA P， GUPTA S， CHAUDHARY M， et al. Oct4 mediates Müller glia reprogramming and cell cycle exit during retina regeneration in zebrafish［J］. Life Science Alliance， 2019， 2（5）： e201900548.

［53］ RAMACHANDRAN R， FAUSETT B， VGOLDMAN D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a lin-28-dependent， let-7 microrna signalling pathway［J］. Nature Cell Biology， 2010， 12（11）： 1101-1107.

［54］ 王松濤， 周國民. 誘導多能干細胞在視網膜疾病研究中的應用［J］. 眼科新進展， 2017， 37（6）： 587-590.

WANG Songtao， ZHOU Guomin. Induced pluripotent stem cells in retinal disease research［J］. Recent Advances in Ophthalmology， 2017， 37（6）： 587-590.

［55］ 任云曉， 肖茹丹， 婁曉敏， 等. 基因編輯技術及其在基因治療中的應用［J］. 遺傳， 2019， 41（1）： 18-28.

REN Yunxiao， XIAO Rudan， LOU Xiaomin， et al. Gene editing technology and its application in gene therapy［J］. Hereditas， 2019， 41（1）： 18-28.

［56］ BROACH J R， GUARASCIO V R， JAYARAM M. Recombination within the yeast plasmid 2mu circle is site-specific［J］. Cell， 1982， 29（1）： 227-234.

［57］ ABREMSKI K， HOESS R. Bacteriophage p1 site-specific recombination. Purification and properties of the cre recombinase protein［J］. Journal of Biological Chemistry， 1984， 259（3）： 1509-1514.

［58］ SAUER B， MCDERMOTT J. DNA recombination with a heterospecific cre homolog identified from comparison of the pac-c1 regions of p1-related phages［J］. Nucleic Acids Research， 2004， 32（20）： 6086-6095.

［59］ LIU K， TANG M， JIN H， et al. Triple-cell lineage tracing by a dual reporter on a single allele［J］. Journal of Biological Chemistry， 2020， 295（3）： 690-700.

［60］ SAJGO S， GHINIA M G， SHI M， et al. Dre-cre sequential recombination provides new tools for retinal ganglion cell labeling and manipulation in mice［J］. PLoS One， 2014， 9（3）： e91435.

［61］ YU W， MOOKHERJEE S， CHAITANKAR V， et al. Nrl knockdown by AAV-delivered CRISPR/Cas9 prevents retinal degeneration in mice［J］. Nature Communications， 2017， 8： 14716.

［62］ CAI Y， CHENG T， YAO Y， et al. In vivo genome editing rescues photoreceptor degeneration via a cas9/Reca-mediated homology-directed repair pathway［J］. Science Advances， 2019， 5（4）： eaav3335.

［63］ OOTO S， AKAGI T， KAGEYAMA R， et al. Potential for neural regeneration after neurotoxic injury in the adult mammalian retina［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（37）： 13654-13659.

［64］ KARL M O， HAYES S， NELSON B R， et al. Stimulation of neural regeneration in the mouse retina［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 105（49）： 19508-19513.

［65］ JORSTAD N L， WILKEN M S， GRIMES W N， et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Müller glia in adult mice［J］. Nature， 2017， 548（7665）： 103-107.

［66］ YAO K， QIU S， WANG Y V， et al. Restoration of vision after de novo genesis of rod photoreceptors in mammalian retinas［J］. Nature， 2018， 560（7719）： 484-488.

［67］ TODD L， FINKBEINER C， WONG C K， et al. Microglia suppress Ascl1-induced retinal regeneration in mice［J］. Cell Reports， 2020， 33： 108507.

［68］ TODD L， HOOPER M J， HAUGAN A K， et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bhlh transcription factors［J］. Cell Reports， 2021， 37（3）： 109857.

［69］ CRAIG S E， CALINESCU A A， HITCHCOCK P F. Identification of the molecular signatures integral to regenerating photoreceptors in the retina of the zebra fish［J］. Journal of Ocular Biology， Diseases， and Informatics， 2008， 1（2/4）： 73-84.

［70］ XU D， ZHONG L T， CHENG H Y， et al. Overexpressing neurod1 reprograms Müller cells into various types of retinal neurons［J］. Neural Regeneration Research， 2023， 18（5）： 1124-1131.