448?nm藍光照射致ARPE-19細胞壞死性凋亡研究

馬瓊 徐天池 康宏向

摘 要：長期超風險限值藍光照射可能導致視網膜變性疾病，而視網膜色素上皮損傷是視網膜光損傷的關鍵來源。本研究探討了448 nm藍光對人視網膜色素上皮細胞的損傷作用及凋亡方式。25 mW/cm2藍光照射ARPE-19細胞3、6、9、12 h，照后即刻采用鈣黃綠素乙酰甲酯染色檢測細胞活性，并在照后24 h采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測壞死性凋亡相關基因表達，同時采用蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測壞死性凋亡和DNA損傷標志蛋白表達。9 h和12 h照射組細胞形態發生顯著變化，表現為細胞腫脹、間隙增大、漂浮細胞增多、細胞碎片增加；藍光照射3～9 h后RIPK1、RIPK3 mRNA表達量較正常組出現明顯升高，且在照射9 h時達到最大值；藍光照射6～12 h后RIPK1、RIPK3、P-MLKL壞死性凋亡蛋白標志物的表達量隨藍光照射時間增加而明顯升高，并在照射12 h時達到最高值；藍光照射3～12 h后DNA損傷標志物γ-H2AX蛋白表達量明顯升高，并在照射12 h時達到最高值。藍光照射9 h壞死性凋亡相關基因表達量達到最大，照射12 h基因表達明顯下降但壞死性凋亡相關蛋白表達量累積到最大，這提示25 mW/cm2藍光照射9～12 h可誘導ARPE-19細胞發生壞死性凋亡，并表明DNA損傷程度與細胞壞死性凋亡發生可能存在關聯。

關鍵詞：藍光；ARPE-19細胞；壞死性凋亡；DNA損傷；光化學損傷

中圖分類號：Q28? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2023.01.006

A Study on the Necroptosis of ARPE-19 Cells Induced by 448 nm Blue Light

MA Qiong1， XU Tianchi1， 2， KANG Hongxiang1*

（1. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Academy of Military Science， Beijing 100850， China; 2. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： Long-term blue light exposure beyond the risk limit is an important factor that causes retinal degenerative diseases， and damage to the retinal pigment epithelium is the key source of retinal light damage. In this study， we investigated the damaging effects of 448 nm blue light on human retinal pigment epithelial （ARPE-19） cells and the mode of apoptosis. ARPE-19 cells were irradiated with 25 mW/cm2 blue light for 3， 6， 9 and 12 hours， and cell activity was detected immediately by Calcein AM staining 24 h after irradiation. RT-PCR was used to examine the expression of necrotic apoptosis related genes 24 hours after irradiation， and the Western blotting was used to examine the expression of necroptosis-related and DNA-damage related proteins. The cell morphology changed significantly in the 9-hour and 12-hour groups， the cells swelled， the intercellular space was enlarged， and a large number of cell fragments and non-adhesive cells were observed. Compared with the normal group， the expression levels of the necroptosis-related genes RIPK1 and RIPK3 were significantly higher 3～9 hours after blue light irradiation， and reached the maximum value at 9 h. The expression levels of necroptosis-related proteins RIPK1， RIPK3， P-MLKL markers significantly increased with the increase of irradiation time after 6～12 h blue light irradiation， and reached the highest value at 12 h. The expression level of DNA damage-related γ-H2AX protein increased significantly after 3～12 h blue light irradiation， and reached the highest value at 12 h. The expression of necroptosis-related genes reached the maximum after 9 hours of blue light irradiation， while the expression of necroptosis-related proteins reached the maximum after 12 hours irradiation. It was speculated that 25 mW/cm2 blue light irradiation for 12 h may cause the necroptosis in ARPE-19 cells， and the degree of DNA damage may be related to the occurrence of necroptosis.

Key words： blue light; ARPE-19 cells; necroptosis; DNA damage; photochemical damage

（Acta Laser Biology Sinica， 2023， 32（1）： 036-042）

隨著LED光源在人們日常生活中的廣泛應用和使用功率的快速提高，其對人體可能帶來的潛在危害越來越受到人們的關注［1-3］。LED光源中波長400～480 nm藍光對人眼損傷最為嚴重［4-5］。藍光對眼部組織的光損傷可引起干眼癥、白內障、年齡相關性黃斑變性等疾病［6］。近幾年來，國內外大量文獻表明，藍光長期暴露后會引起視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞或感光細胞損傷，損傷形式主要以光化學損傷為主，嚴重時引起細胞凋亡或死亡［7-10］。而近幾年新發現的壞死性凋亡方式是否參與藍光誘導的RPE細胞死亡尚不清楚。RPE細胞經4.5 mW/cm2藍光照射6 h后細胞內超微結構發生了顯著性變化，主要表現為細胞器腫脹、胞漿減少、線粒體空泡樣改變及腫脹、細胞核內異染色質減少固縮、常染色質分散［11］，這些細胞形態學變化與壞死性凋亡極其相似。壞死性凋亡信號調控機制復雜且精密，其中腫瘤壞死因子受體參與的信號通路研究較為清晰［12］。為了預防視網膜退行性疾病的產生及減輕或消除視網膜光損傷相關的視覺功能障礙，有必要闡明藍光照射后RPE細胞具體的程序性死亡方式及相關機制。本研究通過448 nm藍光照射人視網膜色素上皮細胞ARPE-19，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）對壞死性凋亡標志物受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、受體相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）、底物混合譜系激酶樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）表達量進行檢測，以探討藍光照射是否會誘導ARPE-19細胞發生壞死性凋亡。另外，本研究還通過檢測DNA損傷標志物蛋白γ-H2AX表達量變化來分析藍光照射是否會引起細胞DNA損傷，并初步探索其與細胞壞死性凋亡的關系，最終為深入研究視網膜藍光損傷和疾病防治提供新思路和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 ARPE-19細胞培養

人視網膜色素上皮細胞株（ARPE-19細胞）購自中國科學院上海細胞庫官網，使用含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM/F12培養基，置于37℃、5% CO2 培養箱中培養。

1.2 主要試劑與耗材

本試驗需要的主要試劑和耗材，如表1所示。

1.3 藍光照射裝置

CO2細胞培養箱加入定制的藍光照射裝置，如圖1所示，LED藍光光源放置在培養箱下層，LED尺寸為14 cm×11 cm，峰值波長為448 nm，半峰全寬為18 nm，使用移動電源供電，上下移動透明鋼化玻璃板以固定藍光照射細胞的垂直距離，細胞培養板放置在光源中心正上方，藍光從下向上照射細胞，并在培養箱四周放置無菌冰袋以確保培養箱內溫度穩定在37℃左右。

1.4 藍光照射細胞方法

ARPE-19細胞接種于10 cm培養皿中，細胞密度為每毫升106個，放入細胞培養箱中孵育12 h，待細胞生長狀態良好后，將細胞培養板放置于藍光照射裝置中進行藍光照射，采用功率計控制細胞培養板處功率，根據細胞板面積設定藍光照射強度為25 mW/cm2，且按藍光照射時間不同分為5組，分別為0、3、6、9和12 h組，其中0 h組為正常組（未進行藍光照射）。

1.5 活細胞染色檢測細胞活性

無色的鈣黃綠素乙酰甲酯進入細胞后可以被活細胞內的酯酶斷裂成發出強綠色熒光的鈣黃綠素，用于活細胞檢測，且該染色試劑的毒性很低，基本不會對細胞造成損傷。藍光照射3、6、9和12 h后，即刻吸去培養基，在正常組和照射各組中各加入200 μL配制好的鈣黃綠素乙酰甲酯工作液，細胞培養箱孵育20 min，PBS緩沖液洗凈未進入細胞的染色試劑，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光染色情況，活細胞有綠色熒光，死細胞則無。

1.6 RT-PCR檢測壞死性凋亡相關基因表達水平

ARPE-19細胞經25 mW/cm2藍光照射3、6、9和12 h后再培養24 h，在冰盒中使用細胞刮刀快速收集正常組和照射各組培養皿上的貼壁細胞，同時將培養基中漂浮細胞一并收集于預冷的PBS緩沖液中；提取細胞RNA，使用超微量分光光度計測定RNA濃度，使OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0，–80℃保存。

引物設計：參考引物庫檢索核苷酸序列，并委托生工生物工程有限公司合成引物，信息見表2。

cDNA反轉錄：在冰盒上建立反轉錄反應體系（總體積為20 μL），如表3所示。渦旋混勻，PCR儀進行擴增得到cDNA模板，反應溫度為37℃反應15 min、85℃反應5 s，4℃暫時保存。

PCR：建立PCR反應體系（總體積為25 μL），如表4所示。按如下程序進行PCR擴增。1）預變性：95℃、30 s；2）PCR反應：39個循環（95℃、5 s；60℃、30 s；72℃、10 min） ；3） 溶解曲線：65～95℃，每0.5℃讀板一次并停5 s。采用??Ct法進行相對定量分析：公式F=2–??Ct，其中?Ct=Ct（目的基因）–Ct（管家基因），??Ct＝?Ct光照組–?Ct對照組。

1.7 Western blot印跡法檢測壞死性凋亡相關蛋白表達水平

ARPE-19細胞經25 mW/cm2藍光照射3、6、9和12 h后再培養24 h，正常組和照射各組使用預冷PBS收集細胞，加入150 μL 放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑），提取細胞總蛋白并制備蛋白樣品，二辛可寧酸測定法（bicinchoninic acid assay，BCA）測定細胞蛋白濃度；上樣與電泳：蛋白樣品直接上樣到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）加樣孔，恒壓條件下80 V電泳30 min，待蛋白預染marker條帶基本分離，電壓調為120 V，繼續電泳約60 min，待溴酚藍接近膠底端附近即電泳結束；轉膜：采用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），使用Bio-Rad標準濕式轉膜裝置，轉膜電流為300～400 mA，轉膜時間為30～60 min；封閉：轉膜完成后，三乙醇胺緩沖鹽水溶液-吐溫緩沖液（Tris buffered saline with Tween 20，TBST）清洗２次，每次5 min，加入快速封閉液并充分覆蓋全膜，置搖床上緩慢搖動，室溫封閉5 min； 一抗孵育：分別加入RIPK1、RIPK3、P-MLKL、MLKL和γ-H2AX一抗抗體（按照體積比為1：1 000的比例稀釋），置搖床上緩慢搖動，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次；二抗孵育：加入二抗（辣根酶標記山羊抗兔lgG），置搖床上緩慢搖動，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次；顯影：使用顯影定影試劑盒進行蛋白顯影；定量分析：使用Image J 軟件定量分析目的蛋白條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），目的蛋白相對表達量為IA（待測蛋白）/IA（內參）比值，試驗重復3次，計算平均值。

1.8 統計學分析

SPSS軟件進行數據處理，數據表示為平均值±標準差（x±s），采用雙尾t檢驗進行統計分析，P<0.05表示具有統計學意義上的差異。

2 結果與分析

2.1 藍光照射后ARPE-19細胞的活性變化

ARPE-19細胞經25mW/cm2藍光照射3～12 h，細胞染色結果如圖2所示：未照射組細胞貼壁良好，基本為綠色熒光的活細胞；3 h和6 h照射組細胞形態開始變模糊，而且6 h組開始出現細胞空隙，存在部分未染色死細胞；9 h和12 h照射組細胞形態發生顯著變化，細胞腫脹，細胞間隙增大，漂浮細胞數量顯著增多，細胞碎片增加，并觀察到大量未染色死細胞。前期15 mW/cm2藍光照射ARPE-19細胞試驗結果顯示，照射3～12 h后再培養24 h，各照射組細胞形態基本恢復到正常水平，且各組之間未見明顯差異；然而25 mW/cm2藍光照射3～12 h，各組細胞形態差異明顯，故25 mW/cm2可作為后續藍光細胞光損傷模型的輻照劑量。

2.2 藍光照射對ARPE-19細胞壞死性凋亡標志物mRNA表達的影響

ARPE-19細胞經25 mW/cm2藍光照射3～12 h，RT-PCR檢測壞死性凋亡相關基因表達水平結果如圖3所示：1）未照射組RIPK1、RIPK3 mRNA均低表達，Ct值分別為35.49和38.50，并將兩者表達量歸一化處理，即表達量為1；

2）與未照射組比較，藍光照射3～9 h后細胞內RIPK1 mRNA表達量明顯升高（P<0.05或P<0.001），且9 h照射組達到最大值，而藍光照射12 h后RIPK1 mRNA表達量出現明顯下降（P<0.001）；3）藍光照射3～12 h后細胞內RIPK3 mRNA表達量先增加后降低，但均明顯高于未照射組，且9 h照射組達到最大值（P<0.05或P<0.001）。

2.3 藍光照射對ARPE-19細胞壞死性凋亡標志物蛋白表達的影響

ARPE-19細胞經25 mW/cm2藍光照射6～12 h，Western blot印跡檢測細胞壞死性凋亡相關蛋白表達水平結果如圖4所示。藍光照射6、9 和12 h后細胞內壞死性凋亡相關的RIPK1、RIPK3和P-MLKL蛋白相對表達量均隨著照射時間增加而增大，且均明顯高于未照射組水平（P<0.001）；同時，各照射組MLKL蛋白相對表達量出現升高，但無統計學意義。以上結果表明，藍光照射可誘導ARPE-19細胞發生壞死性凋亡。

2.4 藍光照射對ARPE-19細胞DNA損傷標記物γ-H2AX蛋白表達的影響

ARPE-19細胞經25 mW/cm2藍光照射3～12 h，Western blot印跡檢測DNA損傷相關蛋白表達水平結果如圖5所示。藍光照射3～12 h后細胞內γ-H2AX蛋白相對表達量均顯著升高（P<0.01），均明顯高于未照射組水平，且12 h照射組γ-H2AX蛋白相對表達量達到844.40±71.77，約為正常組的4倍。以上結果表明，藍光可誘導ARPE-19細胞發生DNA損傷。

3 討論

RIPK1、RIPK3和MLKL是細胞產生壞死性凋亡的主要標志物，其作用的主要過程是腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）與腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）結合后，TNFR1募集TNFR1相關死亡結構域蛋白（TNF receptor 1-associated death domain protein，TRADD）、腫瘤壞死因子受體相關因子2（tumor necrosis factor receptor related factor 2，TRAF2）和Fas相關死亡結構域蛋白（Fas-associated death domain protein，FADD）并形成復合物，隨后RIPK1從細胞膜上解離出來進而轉變為促死亡蛋白［13］。然后，根據外刺激條件不同，RIPK1調控下游相關信號路徑，引發細胞兩種凋亡方式，即凋亡或壞死性凋亡。若RIPK1募集pro-Caspase-8并使其活化，則發生細胞凋亡［14］；若胞內Caspase-8被抑制，則招募RIPK3形成RIPK1-RIPK3復合體，復合體隨后募集MLKL并使其磷酸化為P-MLKL，最終引發壞死性凋亡［15］。MLKL蛋白磷酸化后引起細胞鈣離子內流，磷脂酰絲氨酸從膜內側翻轉到膜表面，最終導致質膜的完整性喪失，細胞死亡［16-17］。在形態學上，壞死性凋亡主要表現為胞膜穿孔，滲透壓升高導致細胞變圓和線粒體腫脹，核染色質缺失，細胞膜發生爆炸式破裂。試驗中觀察到藍光照射后細胞變圓、腫脹等與壞死性凋亡相類似的形態學變化。本試驗結果表明：ARPE-19細胞經25 mW/cm2藍光照射6～12 h后RIPK1、RIPK3、P-MLKL蛋白標志物的表達量隨藍光照射時間增加而明顯升高，并在照射12 h時達到最高值；同時，RT-PCR的試驗結果發現，藍光照射3～9 h后RIPK1、RIPK3 mRNA表達量出現明顯升高，且在照射9 h時達到最大值，但在照射12 h時表達量出現下降。以上結果表明，藍光照射9 h時壞死性凋亡相關基因表達量達到最大，而照射12 h時基因表達明顯下降而壞死性凋亡相關蛋白表達量累積到最大，提示25mW/cm2藍光照射9～12 h可能誘導ARPE-19細胞發生壞死性凋亡。

DNA雙鏈斷裂被認為是電離輻射致細胞殺傷、染色體變異及細胞癌變或死亡最嚴重的損傷之一。細胞對DNA雙鏈斷裂最開始的修復途徑之一就是產生γ-H2AX，然后γ-H2AX與細胞修復相關因子結合，對DNA雙鏈斷裂進行修復［18］。曹忠琦［19］在研究黍子過氧化物酶（proso millet peroxidase，PmPOD）對結直腸癌細胞DNA損傷和壞死性凋亡機制中發現，黍子過氧化物酶、壞死性凋亡抑制劑和抗氧化劑共同處理可以有效抑制結直腸癌細胞的壞死性凋亡，但卻不能抑制結直腸癌細胞DNA雙鏈斷裂，并證實了DNA雙鏈斷裂是細胞產生壞死性凋亡的前提條件。本試驗通過檢測藍光照射后DNA損傷標記物γ-H2AX蛋白表達量來觀察藍光照射后ARPE-19細胞DNA損傷情況，結果表明，藍光照射3～12 h后細胞內γ-H2AX蛋白相對表達量明顯升高，且在照射12 h后達到最大，提示25 mW/cm2藍光照射可誘導ARPE-19細胞發生DNA損傷。進一步分析發現，藍光照射12 h后細胞壞死性凋亡、DNA損傷標記物蛋白表達量都達到最大值，因此推測DNA損傷程度與細胞壞死性凋亡發生可能存在關聯，然而兩者相互關系及其具體機制仍需進一步探索。因此，藍光對ARPE-19細胞損傷結果有助于闡明藍光對眼睛的潛在安全危害，為藍光安全應用提供基礎，并為藍光誘導的視網膜變性疾病提供潛在的治療靶點。

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收稿日期：2022-11-30；修回日期：2023-01-05。

基金項目：國家自然科學基金項目（81901907）。

作者簡介：馬瓊，實驗師，主要從事激光生物學研究。

* 通信作者：康宏向，副研究員，主要從事激光生物學研究。E-mail： khx007@163.com。