馬氏珠母貝Perlucin基因序列特征及其SNP與耐低溫性狀的關系

王 成，賴卓欣，宋欣霖，鐘如卓，鄭 哲,2,3,4，王慶恒,2,3,4

(1.廣東海洋大學水產學院/2.廣東省珍珠養殖與加工工程技術研究中心/3.廣東省珍珠科技創新中心/4.廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088)

C-型凝集素（C-type Lectins,CTL）是一類廣泛分布于生物中的糖類結合蛋白，主要通過細胞黏附和聚集[1,2]、細菌清除[3]和酚氧化酶原激活[4,5]等參與先天性免疫應答，也是固有免疫系統中的重要模式識別受體。Perlucin 是一種典型的C 型凝集素蛋白，在水產動物先天性免疫過程中發揮重要作用：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[6]、雜色鮑（Haliotis diversicolor）[7]、香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）[8]在病原菌感染后Perlucin表達量均顯著升高，表明Perlucin 參與了三者的免疫應答；香港牡蠣重組蛋白ChPerlucin 有抑菌效果[8]。此外，Perlucin 還參與響應環境因子脅迫：在菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）、馬尼拉蛤蜊（Costellipitar manillae）[9]、海螺（Panopea generosa）[10-11]、悉尼牡蠣（Crassostrea commereialis）[12]、紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）[13]和墨西哥象拔蚌（Panopea abrupta）[14]等貝類中均發現Perlucin 參與海洋酸化脅迫響應，在近江牡蠣（Crassostrea ariakensis）中發現Perlucin參與高鹽脅迫的適應調節過程[15]。

溫度是限制動物生長、繁殖和分布的極為重要的環境因子。CTL 參與溫度脅迫響應：菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）鰓組織中的CTL 在低溫脅迫下表達量顯著上升[16]；高溫脅迫會誘導大菱鲆（Scophthalmus maximus）肝臟中的CTL 同源基因SmLec1表達量上升[17]；在鹽沼貽貝（Geukensia demissa）中首次發現Perlucin 和Perlucin-like 蛋白在高溫脅迫下表達顯著上升[18]；在菲律賓蛤仔中，高溫和低溫脅迫均會誘導Perlucin在鰓組織中的表達[19]。由此可見，Perlucin等CTL 可能在貝類的溫度脅迫響應中發揮作用。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國培育海水珍珠的主要養殖貝類之一,屬于暖水性貝類，對低溫的耐受能力弱，自然群體主要分布在深圳以南海域。除目前的主養殖區廣東湛江、廣西北海和海南等地外，廣東北部和福建南部等歷史分布區的耐低溫種群已消失[20]；主養殖區曾多次發生冬季寒潮，導致馬氏珠母貝養殖群體大規模死亡，因此培育耐低溫品系是馬氏珠母貝抵御寒潮乃至北移養殖的前提。賴卓欣[21]通過繼代選擇構建了馬氏珠母貝耐低溫選育系，并通過基因組重測序發現，與北部灣野生群體相比，耐低溫群體包括Perlucin在內的部分基因受到了選擇壓力。本研究從馬氏珠母貝基因組中鑒定到Perlucin基因，通過RACE克隆技術獲得馬氏珠母貝Perlucin基因（PIN_GLEAN_10008410）cDNA 序列全長，對其序列特征、組織表達模式以及群體間SNP 位點進行分析，探究該基因在馬氏珠母貝低溫脅迫和耐受中的功能，為其耐低溫群體培育和種群恢復提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用馬氏珠母貝均采自廣東省雷州市后洪村海區，為外觀正常、生長旺盛、規格基本相似[殼長（69.23±3.80）mm]的1.5 齡馬氏珠母貝。將馬氏珠母貝表面附著物清理干凈，運回實驗室，在22 ℃海水中暫養48 h。隨機取馬氏珠母貝8 只，剪取閉殼肌、鰓、性腺、肝胰腺、足和外套膜（8 個生物學重復），經液氮速凍后轉移至—80 ℃冰箱，備用。另將100 只馬氏珠母貝隨機分成2 組，分別養殖于300 L實驗桶中，以17 ℃為低溫脅迫溫度[22]、22 ℃為對照在空調房中進行溫度脅迫實驗：將室內溫度分別設定為17、22 ℃，使環境溫度一致。每天換水前將經過三層沙濾的海水溫度分別調至17、22 ℃，并用控溫器和冰盒進行溫度保持，換水時使用相同溫度海水以保證養殖溫度的穩定。實驗期間每天投喂等量的小球藻（Chlorella vulgaris），保持微充氣。實驗6、12、24、48、72 h 時，每組分別隨機取8 個個體，剪取鰓組織，經液氮速凍，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1Perlucin基因全長克隆 參考劉雅[22]采用Trizol 法提取馬氏珠母貝閉殼肌、外套膜、鰓、足、性腺和肝胰腺的總RNA，RNA 用20～40 μL DEPC 水（焦碳酸二乙酯處理并經高溫高壓滅菌的去離子水）溶解。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，用Nano DropND1000 紫外分光光度計檢測RNA 的純度及濃度。參照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit的說明書制備5?RACE、3?RACE模板。

利用巢式PCR 擴增獲得Perlucin基因未知的3?和5?序列。反應體系（10μL）：Ex Taq DNA 聚合酶0.1μL，10×Buffer 1μL，dNTPs 1.6μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板0.4 μL，去RNA 酶水5.3 μL。反應程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，40 個循環；72 ℃10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物片段長度，將與目的片段長度一致的PCR 產物連接到pMD19-T 載體，并轉化到DH5α大腸埃希菌細胞中，用LA（含有氨芐）選擇培養基培養，挑取陽性菌送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。用軟件DNAMAN將測序獲得的3?和5?序列與基因組中已知部分（已驗證）[23]拼接，得到全長序列。根據文獻[23]的基因組數據庫Perlucin的部分序列，用軟件Primer Premier5.0 根據引物設計要求設計引物（表1）。

表1 本研究的引物序列Table 1 Primers used in perlucin expression analysis

1.2.2Perlucin的生物信息學分析 用軟件DNAMAN 推導Perlucin基因全長的氨基酸序列；用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）找到Perlucin的開放閱讀框；通過Pfam（https://pfam.xfam.org/search）預測該基因的保守結構域；用ExPASy-ProtParam tool 分析氨基酸的理化性質，SignalP5.1軟件預測信號肽；TMHMM Server軟件分析氨基酸的跨膜結構；采用NCBI COBALT（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/）和DNAMAN9進行多序列比對，Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預測蛋白的三級結構；用MegaX構建生物系統發育樹。

1.2.3Perlucin的組織表達及溫度脅迫下的差異分析 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析Perlucin基因的mRNA 表達。以β-actin為內參基因[22-24]，利用2-ΔΔCt法計算Perlucin基因在不同組織以及在實驗溫度下各時間點的相對表達量。qRTPCR 反應體系（10 μL）：上下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 5 μL，滅菌ddH2O 3.8 μL。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃15 s，72 ℃15 s，45 個循環；熔解曲線為95 ℃10 s，65 ℃60 s，95 ℃1 s。每組各3個樣本。使用SPSS 22.0 軟件對各表達量數據均值進行單因素方差分析，如數據不符合正態分布，則對相對表達量數據進行對數（ln）轉換，使數據符合方差齊性檢驗，再對數據進行鄧肯分析，設定顯著性水平為0.05。結果以平均值±標準差形式表示。

1.2.4Perlucin基因SNP 篩選及分析 外顯子區SNP位點分析的耐低溫選育系F3代（R）和北部灣野生群體（W）30 個個體的基因組重測序數據庫參考文獻[21]。根據文獻[21]獲得R 和W 的全基因組重測序數據，提取Perlucin的外顯子SNP位點；分別利用軟件Popgene32、PIC_CALC、HAP1loview4.2、SPSS22.0 計算SNP 的基因型、基因頻率、多態信息含量（PIC）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）與哈迪-溫伯格平衡（哈-溫平衡，HWE）等遺傳參數，進行群體R和W的卡方檢驗和SNP的差異統計分析。

2 結果與分析

2.1 Perlucin序列分析

馬氏珠母貝Perlucin全序列總長為631 bp，5?端非編碼區（UTR）為55 bp，3?UTR為116 bp，開放閱讀框（ORF）為459 bp，共編碼152 個氨基酸（圖1）。分析其蛋白序列的理化性質，發現其相對分子質量為17 137，分子式為C772H1158N220O206S10，等電點為9.50，具有10 個負電荷的殘基（Asp+Glu）和20 個帶正電荷的殘基數（Arg+Lys）；總平均親水性為-0.184，屬于親水性蛋白。經預測，其保守結構域有1個C型凝集素結構域（Lectin-C），位 于24—149（圖1）。Perlucin 還具有1 個信號肽，位于1—20，預測出1 個跨膜結構（圖2），位于4—16。二級結構預測結果顯示，Perlucin 蛋白序列由28.95%α 螺旋、25.66%延伸鏈、4.61%β轉角和40.79%無規卷曲組成。

2.2 Perlucin多序列比對以及進化樹構建

馬氏珠母貝Perlucin 與紫貽貝（Mytilus galloprovincialisVDH90866.1）、長牡蠣（Crassostrea gigasXP_034311602）、棘冠海星（Acanthaster planciXP_022090740）、海星（Patiria miniataXP_038045941）、歐文蟲（Owenia fusiformisCAH1798313.1）、圓毛好轉蟲（Dimorphilus gyrociliatusCAD5122556.1）、果蠅（Drosophila pseudotakahashiiKAH8352600.1），黑腹果蠅（Drosophila melanogasterNP_001137766）、劍尾魚（Xiphophorus helleriiXP_032422573）、白梭吻鱸（Sander luciopercaXP_031150883）、擬鱷龜（Chelydra serpentineKAG6923368.1）、棱皮龜（Dermochelys coriaceaXP_038234280）、彩冠雉（Penelope pileataNXC48108.1）、鵲雁（AnseranassemipalmataNXI73468.1）Perlucin 的多序列比對結果（圖3）顯示，Perlucin 在不同物種間的N 端保守性較低，但結構域CLECT所在區域較為保守。

圖3 Perlucin的多序列比對分析結果Fig.3 Multiple sequence alignment of Perlucin

上述15個物種的Perlucin蛋白序列的系統發育樹和結構域分析（圖4）顯示，馬氏珠母貝與長牡蠣、紫貽貝的Perlucin聚為一支。

圖4 Perlucin的系統發育樹和結構域Fig.4 Phylogenetic tree and domains of Perlucin

2.3 Perlucin三級結構預測

圖5可見，馬氏珠母貝Perlucin蛋白質三級結構與紫貽貝、白梭吻鱸和棱皮龜基本一致。

圖5 馬氏珠母貝(a)、紫貽貝(b)、白梭吻鱸(c)和棱皮龜(d)Perlucin蛋白三級結構Fig.5 Spatial structure of Perlucin protein in Pinctada fucata martensii(a),Mytilus galloprovincialis(b),Sander lucioperca(c)and Dermochelys coriacea(d)

2.4 Perlucin組織表達及低溫脅迫下的差異表達

在分析健康組織表達數據及低溫脅迫時鰓組織表達數據時，發現數據不符合正態分布，對數據進行對數（ln）轉換后，數據均符合正態分布，組織表達、低溫脅迫鰓組織表達數據的方差齊性檢驗顯著性分別為0.053、0.352，均符合方差齊性檢驗。分析顯示：Perlucin在馬氏珠母貝閉殼肌、鰓、性腺、足、肝胰腺和外套膜中均有表達，在閉殼肌中表達量極低，在鰓中表達量顯著高于除肝胰腺和足以外的其他組織（P ＜0.05）（圖6）；在低溫17 ℃組，馬氏珠母貝Perlucin的表達量先升高后下降，其中在12～48 h顯著高于對照組（P ＜0.05）（圖7）。

圖6 Perlucin基因在馬氏珠母貝不同組織中的表達Fig.6 Perlucin gene expression in different tissues of Pinctada fucata martensii

圖7 17、22 ℃下馬氏珠母貝鰓中Perlucin基因的時序表達Fig.7 Temporal expression of Perlucin gene in gills of Pinctada fucata martensii at 17 and 22 ℃

2.5 Perlucin基因SNP位點遺傳多態性分析

Perlucin基因的外顯子共發現30 個SNP 位點。這些SNP 位點PIC 為0.016 3～0.371 0，其中，21 個位點為低度多態性（PIC ＜0.25），9 個為中度多態性（0.25 ＜PIC ＜0.50）；Ho為0.016 7～0.533 3；He為0.016 7～0.495 2（表2）。

表2 Perlucin基因的SNP多態性Table 2 Haplotype of SNPs in Perlucin gene

2.6 Perlucin基因SNP位點與耐低溫關聯性分析

表3 表明，Perlucin外顯子區域的30 個SNP 位點中，13個SNP位點在群體W 和R之間存在顯著差異（P ＜0.05），表明這13 個SNP 與耐低溫性狀顯著相關。頻率差異最大的前2 個位點如下：g.40078865 的GT 基因型在群體R 和W 中的頻率分別為76.7%和30.0%；g.40078913 的基因型CT 在兩個群體中的頻率分別為73.3%和26.7%；僅在R 群體被檢測到的位點共2 個，分別是位點g.40078856、g.40078945。其中位點g.40078856 為同義突變，位點g.40078945 為非同義突變，在R 群體中AG 基因型，該位點處編碼的氨基酸由精氨酸變為賴氨酸。

表3 Perlucin外顯子SNP位點及其基因型在群體R和W間分布頻率Table 3 Frequency distribution of Perlucin exon SNP loci and their genotypes in populations R and W

3 討論

凝集素在無脊椎動物免疫防御反應中發揮作用，在軟體動物的免疫識別和逆境應答中擔任極重要角色。本研究擴增得Perlucin的全長序列，其具有1 個信號肽，1 個跨膜結構，屬于跨膜蛋白；存在1 個典型的C 型凝集素結構域，說明它屬于典型的C 型凝集素成員。C 型凝集素結構域包含多個糖識別域，可參與吞噬作用[25]，細胞因子釋放[26]、聚集[27]，抗菌活性和細胞黏附[1,28-29]等多種免疫反應。馬氏珠母貝Perlucin 氨基酸結構域序列部分與其他物種的Perlucin相似性較高，表明Perlucin的功能在物種間較為保守，且Perlucin系統發育樹與長牡蠣、紫貽貝等軟體動物聚為一支，區別于脊椎動物和其他無脊椎動物，表明Perlucin在物種分化過程中較為保守。

Dodenhof 等[30]研究發現，Perlucin基因是珍珠層有機基質的蛋白質之一，在生物礦化過程中發揮重要作用。本研究表明，Perlucin基因在與礦化有關的外套膜組織[31]中表達量極低，說明馬氏珠母貝Perlucin基因可能不參與貝殼的鈣化。Perlucin在馬氏珠母貝的鰓和肝胰腺等組織中表達量較高。在香港牡蠣中有類似結果：在多種組織中均有表達,在唇瓣中表達量最高,其次是消化腺（包含肝胰腺）[8]。鰓組織是雙殼貝類抵御外界刺激的第一道防線，是與外界環境接觸的主要器官，在機體抵抗逆境時起重要作用[32]。菲律賓蛤仔通過調節鰓組織的脂肪酸代謝來響應低溫的脅迫[16]，高溫下蝦夷扇貝鰓組織結構變化明顯[33]，說明鰓是貝類響應溫度脅迫的重要器官。本研究對馬氏珠母貝進行低溫脅迫，發現低溫處理組在12 h 時，鰓組織中Perlucin基因的表達量顯著高于對照組，說明低溫脅迫下，Perlucin基因可能參與馬氏珠母貝的低溫脅迫應答。

作為最理想的DNA分子標記，SNP在水產動物的育種研究中有重要作用，陳曉敏等[34]和Du等[35]發現，凡納濱對蝦功能基因CAT、all-53308外顯子SNP位點可能會發生改變，影響到機體的抗逆性。在功能基因轉錄過程中，前體RNA中的內含子區域剪除后留下的外顯子區域轉為成熟的mRNA，然后翻譯成蛋白質。因此，外顯子區域的SNP 位點不僅可作為分子標記，其多態性變化還會影響基因功能。其中，位于編碼區的SNP 位點變化會產生同義突變和非同義突變兩種效應。同義突變雖不引起編碼氨基酸的改變，但可影響基因的轉錄和翻譯等；非同義突變引起蛋白質序列發生改變，從而可能影響蛋白質的功能，導致生物性狀的改變[36]。例如，在人類基因組中，多藥耐藥1 多肽是藥物或其他外源性物質的多特異性外排轉運體蛋白。編碼該蛋白的基因外顯子區域SNP 3435C ＞T 同義突變，影響了RNA 的二級結構，從而導致RNA 穩定性變化，進而導致mRNA 表達的差異[37]。此外，編碼區SNP 多態性還會引發非同義突變，從而引起蛋白功能的變化。例如，在葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC2）基因中的4 個非同義突變導致其酶活性降低[38]。本研究分析了馬氏珠母貝群體R 和W 的Perlucin的外顯子區域，共檢測到30 個SNP 位點，其中13 個位點的基因型頻率在群體W 和R 間差異顯著，位點g.40078856和位點g.40078945的AG 基因型在群體R和W 中的頻率分別為30%和0%，表明在三代的人工選育后形成選擇壓力，其位點基因型頻率的改變可能與選育系低溫耐受能力之間有密切關系，相似于陳琨等[24]和Lai 等[39]對馬氏珠母貝PEPCK和PIAS基因的研究結果。此外，位于基因編碼區的SNP 位點除作為分子標記以外，也可能會引起基因功能變化。本研究中，Perlucin基因有兩個SNP 位點g.40078856(G ＞A)和g.40078945(G ＞A)僅在R 群體被檢測到。位點g.40078856 為同義突變，提示其可能會影響該基因mRNA 的轉錄或穩定性，導致基因表達的變化。g.40078945在R 群體中出現的G 突變導致其發生非同義突變，由精氨酸變為賴氨酸。兩種氨基酸均屬于堿性氨基酸，但賴氨酸的堿性弱于精氨酸，且非同義突變位置在結構域內部，提示其可能會影響到蛋白質的功能，但對蛋白質功能產生的影響還需進一步的實驗驗證。以上研究結果可為進一步深入研究Perlucin基因在馬氏珠母貝應對環境溫度變化的作用機制提供重要參考。

4 結論

本研究通過基因克隆獲得Perlucin基因，開展低溫脅迫實驗，發現馬氏珠母貝Perlucin基因表達量在17°C 低溫組先升高后下降，其中Perlucin的表達量在12～48 h 時比對照組顯著升高。同時通過對馬氏珠母貝R群體和W 群體Perlucin基因SNP分析顯示，位點g.40078856、g.40078945 的基因型AG只在R 群體中被檢測到，說明R 群體中該基因受到了選擇壓力。