復方磺胺甲噁唑人體藥動學與生物等效性研究

張 婷,李夢瑤,姜雅琦,田 杰,郭東生,甘方良

(1.湖北科技學院醫學部藥學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院附屬第一醫院臨床藥理機構辦公室)

復方磺胺甲噁唑為磺胺甲噁唑與甲氧芐啶組成的復方制劑,是一種磺胺類抗菌藥物。磺胺甲噁唑(SMZ)通過競爭對氨基苯甲酸而抑制二氫葉酸的合成,甲氧芐啶通過與二氫葉酸還原酶結合,可逆性的抑制二氫葉酸還原為四氫葉酸。因此,磺胺甲噁唑和甲氧芐啶阻斷了細菌所必需的核酸和蛋白質生物合成的兩個連續步驟[1]。該藥主要用于急性泌尿道感染、尿路感染、呼吸道感染、皮膚化膿性感染、扁桃體炎,肺炎鏈球菌或流感嗜血桿菌所致的2歲以上小兒急性中耳炎,成人慢性支氣管炎急性發作以及志賀氏菌病。根據國家《關于開展仿制藥質量和療效一致性評價的意見》[2],本研究以壽光富康制藥有限公司研制的復方磺胺甲噁唑片和Frontida BioPharm Inc.的原研對照藥(BACTRIM?)進行人體生物等效性研究,以表明本品與原研藥品的療效和質量一致,從而為該藥的上市臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品

復方磺胺甲噁唑片受試制劑T(壽光富康制藥有限公司,規格:磺胺甲噁唑0.4g/甲氧芐啶80mg,批號:15021004);復方磺胺甲噁唑片參比制劑R(Frontida BioPharm Inc.公司,規格:磺胺甲噁唑0.4g/甲氧芐啶80mg,批號:7005301)。

1.1.2 儀器

UPLC I-Class液相色譜儀(美國Waters);Xevo TQ-S質譜儀(美國Waters);數據采集:UNIFI 數據處理軟件(美國Waters);XPE105電子天秤(瑞士METTLER TOLEDO);ST16、ST16R離心機(美國Thermo Fisher);ULTS1368醫用低溫保存箱(美國Thermo Fisher)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試驗對象及設計

空腹試驗篩選66例受試者,入組24例健康志愿者,其中男18例,女6例;平均BMI為(22±2)kg/m2。所有受試者均通過體格檢查,并自愿簽署知情同意書。試驗方案經咸寧市中心醫院倫理委員會批準(批件號:咸醫倫字-Y【2021】008號)。本試驗采用單中心、隨機、開放、單劑量、兩制劑、兩周期、兩序列交叉設計,為空腹給藥人體生物等效性研究,洗脫期為7d。

1.2.2 給藥方法與血樣采集時間點設計

給藥當天受試者按隨機方案單次口服磺胺甲噁唑0.4g/甲氧芐啶80mg T制劑或R制劑。240mL常溫水送服,給藥前及給藥后1h內禁止飲水。在給藥前(0h)以及給藥后10、20、30、45min和1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、8、12、24、36、48h分別采集靜脈血約4mL;測量給藥前(0h)及給藥后1、6、12、24、48h生命體征,試驗全程記錄不良事件。第2周期受試者重復第一周期過程,按隨機方案分別服用另一種制劑。

1.2.3 血漿樣本處理

①空白血漿樣品:取空白血漿50μL至96孔聚丙烯板,加入250μL乙腈,將板密封后在振蕩器上振蕩2min,4000rpm,離心15min。取上清液30μL轉移到另一個96孔聚丙烯板,加入1000μL稀釋劑混勻,將樣品轉移至進樣器中等待進樣。②標準血漿樣品:取標準血漿樣品50μL轉移到96孔聚丙烯板,加入250μL內標工作液YYMMDD-MIX-IS,將板密封后在振蕩器上振蕩2min,4000rpm,離心15min。取上清液30μL轉移到另一個96孔聚丙烯板,加入1000μL稀釋劑混勻,將樣品轉移至進樣器中等待進樣。③零濃度血漿樣品:取空白血漿50μL至96孔聚丙烯板,加入250μL內標工作液YYMMDD-MIX-IS,將板密封后在振蕩器上振蕩2min,4000rpm,,離心15min。取上清30μL轉移到另一個96孔聚丙烯板,加入1000μL稀釋劑混勻,將樣品轉移至進樣器中等待進樣。

1.2.4 色譜條件和質譜條件

①色譜條件:色譜柱,Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm(2.1×50mm);流動相A:2mL乙酸銨水溶液;流動相B:乙腈;梯度走樣,0～0.6min流動相A∶B=85%∶15%;1.2～1.6min流動相A∶B=10%∶90%;2.0min流動相A∶B=85%∶15%;流速:0.35mL/min;柱溫:40℃;進樣量:1μL。②質譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子模式;離子源溫度:150℃;用于定量分析的離子反應分別為:磺胺甲噁唑(SMX):SMXm/z 254.10→108.04;內標磺胺甲噁唑-d4(SMX-d4):m/z 258.06→112.15;甲氧芐啶(TMP):m/z 291.14→230.05;內標甲氧芐啶-d3(TMP-d3)m/z 294.19→230.04;碰撞能量:SMX 18.0 V,SMX-d4 24.0 V,TMP 22.0 V,TMP-d3 22.0 V。

1.2.5 標準曲線和最低定量限(LLOQ)

以待測物與內標的響應比值(Y)為縱坐標,以系列標準血漿樣品濃度(X)為橫坐標,以加權(1/x2)最小二乘法回歸運算得磺胺甲噁唑標準曲線為Y=0.144X+0.00268,r2=0.999143;甲氧芐啶標準曲線為Y=6.77X+0.00881,r2=0.999216。其中磺胺甲噁唑的LLOQ為0.250μg/mL,線性范圍在0.250～50.000μg/mL;甲氧芐啶的LLOQ為0.010μg/mL,線性范圍在0.010～2.000μg/mL。

1.2.6 選擇性與特異性

使用6個不同來源的正常空白血漿,1個來源的高脂空白血漿和1個來源的溶血空白血漿制備空白血漿樣品及使用6個不同來源的正常空白血漿配制的定量下限血漿樣品考察選擇性。每種樣品平行1份。其典型SRM色譜圖見圖1,結果磺胺甲噁唑、甲氧芐啶和內標磺胺甲噁唑-d4、甲氧芐啶-d3的保留時間分別為0.99、1.32、0.98和1.31min。結果符合接受標準,表明本方法測試人血漿中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶具有良好的選擇性,人空白血漿、高脂血漿和溶血血漿對測試無干擾[3-4]。

A.空白血漿樣品;B.最低定量下限樣品;C.零濃度樣品。

1.2.7 精密度、準確度和回收率

考察濃度為LLOQ、LQC、LMQC、HMQC、HQC(磺胺甲噁唑0.250、0.750、6.250、18.750、37.500μg/mL和甲氧芐啶0.010、0.030、0.250、0.750、1.500μg/mL)的質控標準血漿樣品各6份,按1.2.3中②所述方法處理,進樣10μL到色譜/質譜系統分析,代入相應線性回歸方程計算各樣品濃度測定值,據此計算各個濃度水平的批內和批間準確度與精密度。按回歸方程計算實測濃度和提取回收率。結果見表1,符合接受標準,定量下限測得濃度的均值在標示值的80%～120%,其它質控濃度標準血漿樣品測得濃度的均值在標示值的85%～115%;批內批間變異系數均小于15%,表明質控標準血漿樣品的批內和批間的精密度和準確度良好。

表1 血漿樣品批內、批間精密度和準確度測定

1.2.8 樣品穩定性

按照1.2.3中②所述方法配置磺胺甲噁唑和甲氧芐啶低、高濃度質控樣品,考察血漿樣品分別在室溫下放置0、26、46h,在4℃放置39d,10℃放置48h,-20℃放置30d,-70℃凍融4次的穩定性,測得濃度值的變異系數均小于15%,表明穩定性良好。

1.2.9 基質效應

采用8個來源的空白血漿(6個不同來源的正常空白血漿、1個來源的溶血空白血漿、1個來源的高脂空白血漿)不加內標進行處理以獲取空白血漿上清液。取質控工作溶液(SLQC、SHQC)分別用8個來源的空白血漿上清液配制樣品。磺胺甲噁唑濃度為LQC時,經內標歸一化的基質因子的變異系數為6.39%;磺胺甲噁唑濃度為HQC時,經內標歸一化的基質因子的變異系數為8.21%。甲氧芐啶濃度為LQC時,經內標歸一化的基質因子的變異系數為6.49%,甲氧芐啶濃度為HQC時,經內標歸一化的基質因子的變異系數為8.23%,表明無明顯正常空白血漿、溶血空白血漿、高脂空白血漿基質效應,不影響定量分析。

1.2.10 安全性評價方法

基于安全集,按實際給藥情況進行安全性分析。對以下內容進行臨床安全性評估:①任何自發報告的和所有直接觀察到的不良事件、嚴重不良事件;②生命體征任何有臨床意義的改變(參考值范圍90mmHg≤收縮壓<140mmHg,60mmHg≤舒張壓<90mmHg,60次/分≤脈搏(靜息)≤100次/分;以研究醫生判斷為準);③試驗期間體格檢查、實驗室檢查、心電圖檢查等有意義的臨床改變(以研究醫生判斷為準)。

1.3 統計學方法

根據受試者的個體血藥濃度-實際采血結束時間點數據,采用Phoenix WinNonlin 8.2(Pharsight Corporation,Sunnyvale,CA)軟件,以非房室模型法(NCA模塊)對磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的藥動學參數(Cmax、AUC0-t和AUC0-∞)等進行計算。

2 結 果

2.1 血藥濃度-時間曲線和藥動學參數

受試者單次口服T制劑和R制劑的血藥濃度-時間曲線見圖2。口服給藥后1～4h各成分的血藥濃度達到峰值,平均血清半衰期分別為10h和8～10h。藥動學參數計算結果見表2。磺胺甲噁唑T制劑和R制劑的Cmax分別為(27.340±3.400)和(28.042±3.527)μg/mL;甲氧芐啶T制劑和R制劑的Cmax分別為(0.845±0.198)μg/mL和(0.838±0.144)μg/mL(P均>0.05)。

表2 空腹受試者和餐后受試者體內磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的主要藥動學參數

圖2 健康受試者空腹口服受試制劑T和參比制劑R

2.2 生物等效性評價

本試驗中,針對磺胺甲噁唑,受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞藥動學參數最小二乘幾何均值比的90%置信區間分別為94.41%～100.19%、98.70%～102.46%和98.52%～102.41%;針對甲氧芐啶,受試制劑與參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞藥動學參數最小二乘幾何均值比的90%置信區間分別為92.69%～108.36%、100.97%～106.91%和100.86%～106.48%;均落在80.00%～125.00%判定范圍內,表明空腹條件下,兩制劑在吸收速度和吸收程度上均生物等效。結果見表3。

表3 受試者口服受試制劑T和參比制劑R生物等效性分析

2.3 安全性評價

本試驗整個過程中兩組均無嚴重或導致脫落的不良事件,安全性良好。受試制劑組:在進入PKPS的24例受試者中,最終完成兩周期試驗有23例。在服藥的23例受試者中,4例受試者共發生10例次不良事件,轉歸為5例次無改變、4例次痊愈和1例次未知,不良事件發生率為17.4%,不良事件嚴重程度均為1級。參比制劑組:在服藥的24例受試者中,5例受試者共發生8例次不良事件,轉歸為3例次緩解和5例次痊愈,不良事件發生率為20.8%。2例次不良事件嚴重程度為2級,其余6例次不良事件嚴重程度均為1級。

3 討 論

本試驗研究設計計算得空腹正式試驗所需的最終受試者例數為20例。另考慮約20%的脫落率,空腹正式試驗所需的最終受試者例數確定24例。本試驗受試制劑和參比制劑中SMX和TMP幾何均值比的90%CI均落在80.00%～125.00%,表明復方磺胺甲噁唑片受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

SMZ和TMP在口服給藥后1～4h各成分的血藥濃度達到峰值,本試驗0～4h內共采血11次,平均血清半衰期分別為10h和8～10h,給藥24h后血液中可檢出SMZ和TMP,給藥3d后達到穩態狀態,SMZ和TMP均為CYP3A4的底物,根據人體生物等效性指導原則,考慮代謝酶的影響,在保證藥物代謝完全的基礎下,清洗期選取7d。

本試驗受試制劑組和參比制劑組不良反應發生率分別為4.3%、8.3%,1例不良反應嚴重程度為2級,其余均為1級。據文獻報道[5-7],SMZ和TMP在體內代謝受諸多因素的影響,例如機體因素、肝功能障礙、飲食因素、遺傳因素等,不良反應較多,變異較大。本次試驗中SMX和TMP的AUC個體間變異最大值分別為3.81%和5.35%。對于長期用藥的病人其代謝產物排泄較慢,已經超過體內藥物積蓄,為了減少不良事件的發生,建議臨床用藥時加強藥物監測,注意用藥的合理性與安全性[8]。