高糖高脂促進人臍靜脈內皮細胞間充質轉化*

寧宇陽,堯 青,徐 魁,劉 超**

(1.湖北科技學院醫學部藥學院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室;3.湖北科技學院附屬第二醫院內二科)

內皮細胞間充質轉化(endothelial-mesenchymal transition,End-MT)是一個復雜的細胞分化過程,在一定的生理和病理條件下,內皮細胞向間充質細胞轉化,降低內皮特性,獲得間充質特征[1]。內皮細胞覆蓋于所有的血管腔表面,是一個重要的功能性界面。在各種內外因素如高血壓,吸煙的刺激下,內皮細胞發生間充質轉化,導致內皮細胞遷移能力增強,使內皮細胞更容易脫離原來的位置,影響血管內膜層完整性[2];此外,內皮細胞維護血管收縮舒張平衡的功能在此情況下明顯受損。因此,可以說End-MT損傷了內皮細胞的物理及生化等多方面功能。

目前,End-MT的發生發展常用體外細胞培養系統進行研究。通常,原代內皮細胞(ECs)或ECs系通過化學或物理刺激誘導發生End-MT。有研究表明,轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)與IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子可引起End-MT,參與內皮功能障礙[3-4]。在其中應用最廣泛的是TGF-β1刺激5～8d[5],從而引發End-MT。隨著研究的不斷深入,End-MT在動脈粥樣硬化,心臟和腎臟纖維化、肺動脈高壓、癌癥等多疾病中的作用被逐漸重視[6-7]。

慢性高糖(high glucose,HG)是糖尿病血管并發癥的主要誘因,糖尿病患者因胰島素抵抗可致能量利用與消耗的失衡,造成糖脂代謝紊亂,使得內皮細胞間充質從而轉化成為平滑肌細胞,導致血管內膜增厚,管腔狹窄,引發血管病變[8]。目前高糖高脂是否對End-MT有刺激效果,以及是否參與內皮功能障礙尚不確定。本文擬探究高糖高脂刺激對內皮細胞(HUVEC)的End-MT作用,為未來間充質轉化實驗提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器:倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司);全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司);化學凝膠成像系統(英國Syngene公司);二氧化碳培養箱(美國Eppendorf公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);Milli-Q Synthesis超純水系統(美國Millipore公司)。

試劑:游離脂肪酸游離牛血清白蛋白(BSA,批號SRE0098)、棕櫚酸(PA,批號P0500)為Sigma公司產品;內皮細胞培養基ECM(Cat No.1001)為Sciencell公司產品;胎牛血清(FBS)和胰酶為Gbico公司產品;BCA蛋白定量試劑盒(批號P0012S)、RIPA細胞裂解物(批號P0023A)均為碧云天公司產品;一抗稀釋液(武漢塞維爾生物);一抗,兔抗VE-Cadherin (批號A22659);兔抗α-Smooth Muscle Actin(ACTA2)(批號A7248);兔抗Platelet endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1/CD31)(批號A0378);兔抗N-Cadherin(批號A19083)等為ABclonal公司產品;β-actin(批號58169)為CST公司產品。

細胞:人臍靜脈內皮細胞(HUVEC細胞,武漢華聯科生物公司)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC細胞,武漢華聯科生物公司),37℃ 5.0%CO2培養箱培養,當細胞密度鋪滿約90%培養皿底時,采用0.25%胰酶消化后進行傳代。從第6代HUVEC細胞開始進行刺激,先將培養細胞所用的ECM培養基換為無血清培養基,然后隨機分組。分別采用20ng/mL的TGF-β1或者33mmol/L高糖加0.15mmol/L棕櫚酸,來對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)進行轉化刺激。根據處理條件的不同,第6代HUVEC將細胞分為CON組、HG+HP組(33mmol/L高糖加0.15mmol/L處理)、TGF-β1組(20ng/mL處理)。

1.2.2 Western blot法

對HG+HP組和CON組的HUVEC細胞加入細胞裂解液,冰上裂解10～15min然后刮下細胞離心提取蛋白,使用BCA蛋白質測定試劑盒測量各組細胞的蛋白質濃度。校正濃度后,每組以校正后體積進行8%SDS-PAGE凝膠電泳,后將蛋白以350mA、90min濕轉至PVDF膜上,脫脂牛奶封閉后,在4℃孵育所需的一抗(1∶1000)12～16h,然后用TBST洗膜,加入相對應的二抗(1∶5000),以ECL化學發光底物顯色后成像,ImageJ軟件分析測試結果。

1.2.3 免疫熒光檢測

選取處于對數生長期的細胞,消化、重懸后將懸液接種于含有細胞爬片的24孔板中,于37℃細胞培養箱中培養12h,采用20ng/mL的TGF-β1或者33mmol/L高糖加0.15mmol/L棕櫚酸進行刺激,72h后進行免疫熒光實驗,甲醛室溫固定10min,0.1%Triton處理10min,3%BSA室溫封閉1h,加入一抗4℃避光過夜,二抗室溫避光孵育1h,加入適量DAPI染色5min,以上各步驟之間均用PBS緩沖液洗滌3～4次,5min/次,然后用抗熒光淬滅劑封片,并在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 高糖高脂刺激對HUVEC細胞形態的影響

CON組細胞邊界清晰,胞質豐富,形態為圓形、短梭形或扁平形,細胞間連接緊密,可融合成片呈鋪路石樣。在經過TGF-β1或高糖高脂處理72h后,細胞形態發生顯著改變。TGF-β1組細胞形態逐漸向長梭形轉變,細胞間連接變少,間隙變大,HG+HP組細胞形態與TGF-β1組相似,且細胞更加稀疏(圖1)。

圖1 高糖高脂刺激對于HUVEC細胞的影響

2.2 高糖高脂對HUVEC細胞間充質轉化相關蛋白的影響

高糖高脂刺激后,HUVEC間充質轉化的標志性蛋白表達增加,內皮細胞向間充質細胞轉化特征就是內皮細胞特異性標志物表達相應減少,而對應的是間充質細胞特異性標志物相應增加。如圖2A、B、C所示,與CON組相比,HG+HP組內皮細胞標志物血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)丟失,表達明顯下調(P<0.05)。而間充質細胞標志物平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達明顯上調(P<0.05)。同時與CON組相比,HG+HP組血小板內皮細胞黏附分子CD31表達下調(P<0.05),而神經鈣黏素(N-cadherin)表達上調(P<0.05)。證明經高糖高脂的刺激后HUVEC細胞發生了明顯間充質轉分化。

與CON組相比,*P<0.05,n=3。

2.3 免疫熒光測定高糖高脂刺激后HUVEC間充質轉化相關蛋白表達情況

采用免疫熒光檢測高糖高脂干預72h后細胞蛋白CD31、α-SMA及VE-cadherin的表達。免疫熒光結果顯示高糖高脂組和TGF-β1組較正常組血小板內皮細胞黏附分子CD31表達下調(圖3),間充質細胞標志物平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達明顯上調(圖4)。同時如圖5,TGF-β1組與高糖高脂組較正常組內皮細胞標志物血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)表達明顯下調。證明經高糖高脂刺激后,HUVEC細胞發生了明顯間充質轉分化。

圖3 免疫熒光測定CD31表達情況(標尺:5μm)

圖4 免疫熒光測定α-SMA表達情況(標尺:5μm)

圖5 免疫熒光測定VE-cadherin表達情況(標尺:5μm)

3 討 論

血管內皮細胞結構和功能改變是血管病變發生的重要因素。正常血管內皮不僅覆蓋在血管腔表面保護血管平滑肌,而且是重要的內分泌器官和效應器官[9]。血管內皮細胞參與機體的凝血、免疫、物質轉運和生物活性物質釋放等重要的生命活動,可以產生內皮依賴性因子,起調節血管張力、血管生長、血小板功能和凝血功能等作用。同時內皮功能失調會導致血管舒縮性受損,增加炎癥細胞黏附[10]。內皮功能失調在心血管等疾病的發生發展中起重要作用,同時也是糖尿病高血糖損傷血管的重要靶標[11]。糖尿病造成的持久性高血糖會對血管造成彌散、廣泛損傷,導致血管結締組織基質成分顯著改變,平滑肌細胞增殖,膠原過度表達,血管壁纖維化、硬化、管腔狹窄,并且可能引發血流紊亂,最終造成血流動力學障礙[12],這種血流動力學障礙成為動脈粥樣硬化等血管疾病發生發展的力學基礎。綜上所述,糖尿病血管病變基礎是可能是由于血管內皮細胞損傷所致,因此,保護血管內皮細胞對糖尿病及其并發癥的治療非常重要。

內皮功能障礙的機制復雜,End-MT可部分參與內皮功能障礙的過程,且內皮損傷導致的血管功能障礙與動脈粥樣硬化關系密切[13]。而動脈粥樣硬化被認為是心血管疾病共同的病理基礎,這種血管內皮細胞的功能障礙是導致動脈粥樣硬化的前期病變因素[14]。有研究表明,內皮細胞在剪切應力、促炎因子、缺氧等生理或病理因素的刺激下,相關通路包括轉化生長因子-β,Notch、Ras等被激活,進而促進End-MT的發生發展,End-MT在血管疾病發生發展的各個階段——早期內皮功能紊亂、斑塊形成、斑塊不穩定性及晚期血管鈣化都發揮重要作用[15]。

本文研究發現高糖高脂刺激可以促進人臍靜脈內皮細胞HUVEC表達間充質細胞標志物,發生表型轉化;同時,在該刺激下內皮細胞標志物表達下調。值得注意的是,本文中的HUVEC在經歷細胞傳代6代,給予TGFβ1和高糖高脂刺激會取得最好的間充質轉化效果。糖尿病血管并發癥是否由高糖高脂刺激引發的End-MT而造成尚未明確,同時,高糖高脂引起End-MT的具體分子機制和作用靶點有待進一步研究。未來可進一步探索End-MT與糖尿病血管并發癥之間的聯系,為減輕糖尿病血管病變提供新策略和理論依據。