胸腹水細胞蠟塊制作方法的改良及應用

鄭海燕，方慶全，王玉環*

（廈門大學附屬第一醫院病理科，廈門 361003）

胸腹水脫落細胞學檢查因其取材方法簡單、方便、快捷、創傷小等優勢已成為病理檢查的常規方法[1]。傳統細胞學涂片常因其細胞量少、細胞退變、結構不清、或細胞與雜質混雜重疊等原因，導致細胞學診斷困難。液基細胞學檢查雖然改善了傳統細胞學的制片質量，但此檢查方法處理的細胞樣本不易獲得細胞排列方式和背景對照細胞，導致難以鑒別可疑癌和高分化癌細胞、反應性間皮細胞和間皮瘤等[2]，如果將胸腹水標本加以處理制成細胞蠟塊，就可以很好地保持組織細胞的完整性，細胞蠟塊中細胞排列保留了與實體組織類似的結構，并且細胞蠟塊能進行后續特殊染色、免疫細胞化學染色、原位雜交、PCR 等分子生物學檢測，將大大提高胸腹水脫落細胞病理學診斷的準確性，為靶向治療提供可靠的依據[3]。本研究探討3 種不同固定方法對胸腹水沉淀物制作細胞蠟塊效果的影響，以期獲得較佳的胸腹水細胞蠟塊制作方法，提高診斷的準確率，現報道如下。

材料與方法

1 材料

收集2022 年6 月至12 月廈門大學附屬第一醫院病理科細胞學涂片確診見腫瘤細胞的胸腹水標本48 例，其中胸水標本42 例，腹水標本6 例；男21例，女27 例；年齡25 ～84 歲。

2 方法

將送檢的新鮮胸腹水標本靜置0.5 ～1 h，棄去多余上清液，混勻剩余液體后均分成A 組、B 組、C組，3000 r/min 離心5 min，棄上清。A 組加入5 倍以上體積的4%中性甲醛固定液固定4 h，棄上清后直接取出沉淀物，用包埋紙包裹后放入脫水盒常規脫水、包埋、切片、染色；B 組加液基細胞學檢查指定保存液固定4 h，棄上清后直接取出沉淀物，用包埋紙包裹后放入脫水盒常規脫水、包埋、切片、染色；C 組加入5 倍以上體積的4%中性甲醛固定液，混勻，固定5 min，3000 r/min 離心5 min，棄上清，加入75%乙醇，1 min 后吸棄75%乙醇，加入適量的95%乙醇，室溫下靜置塑形2 h，倒去上清液，用包埋紙包裹后放入10%中性甲醛，進入脫水程序，如果沉淀物較大者，用取材刀沿縱軸每間隔3 mm 平行切開，取其切面作為包埋面（D 組），包埋紙包裹后放入脫水盒常規固定、脫水、包埋、切片、染色。

選取肺腺癌細胞蠟塊切片進行HRP Multimer 法免疫組織化學染色，所用一抗包括抗細胞角蛋白7（CK7）、新天冬氨酸蛋白酶 A（napsin A）、甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）均購自福州邁新公司。采用瑞士羅氏公司Ventana Benchmark XT 或Ventana Benchmark ULTRA 全自動免疫組織化學儀染色。免疫組織化學切片的陽性信號均呈棕黃色顆粒狀。CK7 陽性定位于胞質和胞膜，napsinA 陽性定位于胞質，TTF-1 陽性定位于細胞核。

3 統計學分析

數據分析采用SPSS26.0 統計軟件，計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗分析組間差異，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

1 甲醛液固定后聯合95%乙醇塑形細胞蠟塊制作成功高

C 組細胞蠟塊制作成功率為100%（48/48），顯著高于A 組的72.9%（35/48，χ2=15.04,P＜0.01），也顯著高于B 組的60.4%（29/48，χ2=23.69,P＜0.01）。

2 甲醛液固定后聯合95%乙醇塑形細胞蠟塊肉眼觀質量優

A、B 組固定后獲得的沉淀物較松散，易破碎（圖1A、B）；C 組固定后獲得的沉淀物聚集成塊、富有彈性、結構完整、可見細胞層次（圖1C）；沉淀物較大者，沿縱軸每間隔3 mm 平行切開，取其切面作為包埋面，可更大限度的保存標本（圖1D）。

圖1 不同固定方式制成的細胞蠟塊肉眼觀。A，4%中性甲醛固定組；B，液基細胞學保存液固定組；C，甲醛固定后乙醇塑形組；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組Fig. 1 Macroscopic view of cell wax blocks made by different fixation methods. A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, ethanol molding after formaldehyde fixation, large precipitate parallel incision along the longitudinal axis group

3 甲醛液固定后聯合95%乙醇塑形細胞蠟塊切片HE 染色結果較佳

A 組細胞量偏少，HE 染色較鮮艷，細胞輪廓較清晰，細胞排列較清楚（圖2A）；B 組細胞量少，HE 染色偏紅，細胞排列方式基本可見，細胞核保存欠佳，部分核有固縮現象（圖2B）；C 組細胞量大，HE 染色鮮艷，細胞輪廓清晰，細胞排列清楚可見，腫瘤細胞的核仁比較明顯（圖2C）；D 組可以最大面積的暴露組織切面，獲得更多的目的細胞，細胞量大，HE 染色鮮艷，細胞輪廓清晰，細胞排列清楚可見，腫瘤細胞的核仁比較明顯（圖2D）。

圖2 細胞蠟塊切片HE 染色鏡下形態。A，4%中性甲醛固定組（箭示核不規則的腫瘤細胞）；B，液基細胞學保存液固定組（箭示印戒樣腫瘤細胞）；C，甲醛固定后乙醇塑形組（箭示染色質增粗的腫瘤細胞）；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組（箭示核大而不規則的腫瘤細胞）；比例尺，100 μmFig. 2 Morphology of cell wax block section under HE staining. A, 4% neutral formaldehyde fixation group (arrow indicating a tumor cell with irregular nucleus); B, liquid-based cytology preservation solution fixation group (arrow indicating a signet ring cell-like tumor cell); C, formaldehyde fixed and ethanol molding group (arrow indicating a tumor cell with coarse chromatin); D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group (arrow indicating a tumor cell with large and irregular nucleus); scale bar, 100 μm

4 甲醛液固定后聯合95%乙醇塑形免疫組織化學標記效果較好

A、B、C、D 4 組細胞蠟塊切片的CK7 免疫組織化學表達效果均較好，陽性標記清晰易判，背景干凈（圖3A—D）；A、C、D 3 組細胞蠟塊切片的napsin A免疫組織化學表達效果均較好，陽性標記清晰易判，背景干凈（圖4A、C、D），B 組細胞蠟塊切片napsinA 免疫組織化學表達效果欠佳，陽性標記稍減弱（圖4B）；A、B、C、D 4 組細胞蠟塊的TTF-1 免疫組織化學表達效果均較好，陽性標記清晰易判，背景干凈（圖5A—D）。

圖3 細胞蠟塊（胸水肺腺癌細胞）CK7 免疫組織化學檢測。A，4%中性甲醛固定組；B，液基細胞學保存液固定組；C，甲醛固定后乙醇塑形組；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組；箭示陽性表達；比例尺，100 μmFig. 3 Immunohistochemical examination of CK7 in cell wax block (lung adenocarcinoma cells in pleural effusion). A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group; arrows indicate positive expression; scale bar, 100 μm

圖5 細胞蠟塊（胸水肺腺癌細胞）TTF-1 免疫組織化學檢測。A，4%中性甲醛固定組；B，液基細胞學保存液固定組；C，甲醛固定后乙醇塑形組；D，甲醛固定后乙醇塑形，沉淀物較大沿縱軸平行切開組；箭示陽性表達；比例尺，100 μmFig. 5 Immunohistochemical examination of TTF-1 in cell wax block (lung adenocarcinoma cells in pleural effusion). A, 4% neutral formaldehyde fixation group; B, liquid-based cytology preservation solution fixation group; C, formaldehyde fixed and ethanol molding group; D, formaldehyde fixed and ethanol shaped, the precipitate was larger and cut parallel along the longitudinal axis group; arrows indicate positive expression; scale bar, 100 μm

討 論

目前胸腹水脫落細胞學檢查的幾種方法各有其優劣勢。常規離心涂片法是病理科常規開展的項目，操作簡單，出報告快，但與技術員的技術水平密切相關，細胞沉淀取樣不當、涂片厚薄不均等均會影響病理診斷結果，如果發現可疑腫瘤細胞，難以進行進一步的檢測導致不能完成定性診斷；液基細胞學制片法在樣本細胞量比較少時可以得到較高質量涂片，但儀器與耗材成本較高，不適合基層小型醫院開展[4]；細胞蠟塊技術[5,6]將松散的細胞、組織碎片用石蠟包埋制成蠟塊，具有保存細胞新鮮、抗原保留完整、可長期保存、可反復連續切片、能進行特殊染色、免疫組織化學、分子檢測等，可提高診斷的準確性。

本實驗比較了3 種不同固定方法制作胸腹水細胞蠟塊的效果。A 組采用單純的10%中性緩沖甲醛液作為交聯劑，可以與蛋白質相互交聯而發生沉淀，從而較好地保持細胞的完整性，穿透性較好，使細胞收縮小，對大多數抗原物質保存較好，但存在細胞不易凝結成塊的缺點，所以細胞丟失嚴重，沉淀物不易成型，易破碎,存在一定的制作失敗率，有一定比例的漏診率。B 組采用液基細胞學檢查指定保存液作為固定劑[7]，是一種以乙醇為基礎的紅色固定劑，其主要成分可以溶解紅細胞并沉淀蛋白，并含有脂肪酸，實驗過程中發現此方法固定后細胞不易取樣包埋，存在較高的制作失敗率，而且所得的細胞蠟塊HE 染色伊紅深染偏紅，部分細胞空泡化，部分核有固縮現象，免疫組織化學標記效果欠佳，分析原因是固定液中的脂肪酸被醇類變性，影響蛋白質形成超聚集體，不利于包埋等操作，并且影響后續的染色，因此，B 組方法存在一定的漏診率與誤診率。C 組采用10%中性甲醛固定后再用乙醇進行塑形，然后制成細胞蠟塊，不僅制作細胞蠟塊成功率高，而且細胞蠟塊切片HE 染色與免疫組織化學檢測效果均很好。

作者通過比對95%乙醇塑形0.5 h、1 h、2 h 的效果發現：95%乙醇分別塑形0.5 h、1 h 后，多數沉淀物存在半固態現象，沉淀物無法完全取出，試管壁會有部分沉淀物殘留；95%乙醇塑形2 h 后，沉淀物呈固態，可完整取出，試管壁無殘留，HE 及免疫組化染色結果良好，獲得的細胞數量較塑形0.5 h 與1 h明顯增加。因此，采用95%乙醇塑形2h 后制作細胞蠟塊的方法較佳[1]，制作成功率高。10%中性緩沖甲醛液作為交聯劑，可以與蛋白質交聯沉淀，可以較好保持細胞的完整性，穿透性好，細胞收縮小，對大多數抗原物質保存較好。95%乙醇為脂溶性有機溶劑，可幫助細胞沉淀凝固成塊，便于塑形，獲得的組織塊完整，實驗得出此聯合固定法得到的細胞蠟塊HE 染色鮮艷，能清楚地展現完整的細胞形態與結構，免疫組織化學標記清晰容易判讀。

血性胸腹水離心后，沉淀物經 10%中性甲醛固定后再用乙醇塑形，可聚集成塊。如果沉淀物內含有腫瘤細胞，則沉淀物會分為上下兩層，上層為腫瘤細胞層，下層為血漿層，若沉淀物較大時，需用取材刀沿縱軸每間隔3 mm 平行切開，取其切面作為包埋面，這樣制作細胞蠟塊具有以下優點：①蠟塊面橫向分為腫瘤細胞層與血漿層，制作切片時，由于包埋面是平面，所以不需要深修蠟塊，直接切片即可，不僅方便切片，還可最大程度地保護珍貴的細胞蠟塊內的樣本；②細胞蠟塊內擁有3 mm 厚的組織，不會因過度修片或者多次切片將腫瘤細胞層切光；③由于用切出來的平面作為包埋面，所以容易分辨，包埋此類細胞蠟塊時極為方便，不用擔心錯將血漿層作為包埋面，也就不會因包埋面錯誤造成漏診。

綜上所述，胸腹水沉淀物先固定后塑形再固定的方法操作簡便、成本低、制作成功率高、實用性強、效果好，能有效保護細胞形態、抗原、核酸等，能長期保存標本，有利于后續做進一步的檢測，值得推廣。