LINC02038 與子宮內膜癌發生、發展的關聯性分析

趙二勇 陳悅霖 易莉莎 林佩萱

廣州市婦女兒童醫療中心（廣東廣州 510180）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤，發病率和病死率持續上升，并呈現發病年輕化的趨勢［1-2］。EC可按臨床病理特征分型為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。Ⅰ型EC多發于肥胖的圍絕經期婦女，與雌激素水平升高有關；Ⅱ型EC主要發生在瘦弱的絕經后老年婦女中，與雌激素無直接關聯［3］。EC早期無特異性表現，缺乏可靠的早期篩查手段，確診常已屬中晚期，預后較差，因此開發新型生物標志物用于EC早期檢測和靶向治療意義重大［4］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的轉錄產物，在多種生物學過程中發揮關鍵調控作用［5-6］。lncRNA既可以與DNA發生相互作用調控基因轉錄，也可以與RNA或蛋白質相互作用后轉譯調控蛋白活性，從而影響正常細胞生理功能［7］。越來越多研究證實lncRNA表達失調可導致疾病發生［8-9］。lncRNA與腫瘤的起始、發展、侵襲轉移等密切相關，是癌癥精準診療和預后預測的新型生物標志物［10-11］。

目前大量新發現的lncRNA在腫瘤中的功能機制尚未完全明確。基因間區長鏈非編碼RNA 02038（long intergenic noncoding RNA 02038，LINC02038）是一種新報道的基因間區lncRNA，位于人類第3號染色體上，長度為2.1 kb，包含3個外顯子。有研究顯示，LINC02038在結直腸癌組織的表達量明顯降低，LINC02038吸附微小RNA 552-5p（miR-552-5p）阻斷靶基因序列相似性家族 172（family with sequence similarity 172 member A，FAM172A）的降解而抑制結直腸癌細胞的增殖、活力、遷移和侵襲能力［12］。但該新lncRNA與EC關系的研究尚未見報道，本研究擬利用臨床樣本檢測LINC02038在EC組織的表達情況，分析其表達與EC發病、臨床進展的關系，利用功能學實驗分析該lncRNA在體內外模型中對EC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，并結合癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等公共數據系統闡明該lncRNA的生物學功能和潛在機制，為EC的科學防治提供線索。

1 材料與方法

1.1 研究對象選擇

本研究收集我院2019年1月—2022年12月行手術治療并經病理確診為EC的患42例者標本。所有標本均在切除后立即冷凍保存。納入患者均未在術前接受過化學治療、靶向治療或內分泌治療。本研究經醫院醫學倫理委員會審批（倫理批件號：穗婦兒科倫批字［2022］第313B01號），并征得患者知情同意。42例EC患者年齡為32～71歲，平均（54.4±11.3）歲。按照國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期，I～Ⅱ期患者36例、Ⅲ～Ⅳ期患者6例；病理類型主要為子宮內膜樣腺癌（38例），非子宮內膜樣腺癌4例；病理分級為G1 級16例、G2～G3級26例。

1.2 主要試劑和儀器

本研究所用RPMI 1640培養基和新生牛血清購自Hyclone公司（美國），LipofectamineTM 3000轉染試劑購自Invitrogen公司（美國）。Ishikawa細胞購自廣州速研生物科技有限公司（中國）。CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司（中國）。Trizol總RNA提取試劑、SYBR Green PCR熒光定量試劑盒購自大連寶生物工程公司（中國）。Transwell小室和Matrigel基質膠購自賽默飛公司（美國），PCR引物由生工生物工程公司（中國）合成。實驗檢測所用酶標儀為BioTek公司產品（美國），實時熒光定量PCR儀器為ABI公司產品（美國），倒置顯微鏡為Olympus公司產品（日本）。

1.3 實驗方法

1.3.1 LINC02038過表達載體的構建 利用UCSC數據庫獲得LINC02038基因的全長cDNA序列，設計PCR引物用于擴增其全長基因片段。采用In-Fusion技術，將PCR產物克隆插入pcDNA3.1表達載體的XhoI和BamHI限制酶切位點，構建過表達重組質粒pcDNA3.1-LINC02038。質粒擴增產物送測序驗證插入序列的正確性。

1.3.2 穩定過表達細胞株的建立 使用Lipofectamine 3000轉染試劑將pcDNA3.1-LINC02038和空載體pcDNA3.1轉染對數生長期的Ishikawa細胞，48 h后加入G418進行篩選，獲得LINC02038穩定過表達細胞株及對照組。采用實時定量熒光PCR法（realtime quantitative PCR，RT-qPCR）檢測轉染效率。Ishikawa細胞株在37 °C、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱內，使用含10%胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培養基進行傳代培養。

1.3.3 RT-qPCR法檢測基因表達水平 采用Trizol法提取細胞或組織總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。設計LINC02038和內參基因β-actin的特異性引物，應用SYBR Green PCR系統檢測基因的相對表達量。LINC02038上游引物：5ˊ-AGAGGCCAGCTCTCATCTGA-3ˊ，下游引物：5ˊ-TAGAGGAGCCGGTTCCATGA-3ˊ；β-actin內參上下游引物分別是5ˊ-GGCGG CACCACCATGTACCCT-3ˊ和5ˊ-AGGGGCC GGACTCGTCATACT-3ˊ。qPCR反應體系為25 μL，包含上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 10 μL，SYBR Green Mix 12 μL。PCR擴增條件設置：95 °C預變性5 min；95 °C 15 s，60 °C 1 min，共40個循環。

1.3.4 細胞功能實驗 CCK-8法檢測細胞增殖能力。取對數生長期的轉染細胞，以500 /孔密度接種96孔細胞培養板，每孔體積100 μL，設5個復孔。分別在接種0、1、2、3、4 d，每孔加入CCK-8試劑10 μL，避光孵育2 h后，酶標儀檢測450 nm波長光密度值，繪制細胞生長曲線。使用孔徑8 μm的Transwell小室進行細胞遷移實驗，使用預包被Matrigel基質膠的Transwell小室進行細胞侵襲實驗。取對數生長期細胞制備1×105/mL的單細胞懸液，取200 μL細胞懸液接種于小室內層，600 μL 含10%胎牛血清培養基于小室下層。常規培養48 h后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗去除未遷移細胞，甲醛固定、結晶紫染色。棉簽輕拭去小室上層細胞，顯微鏡下隨機選取6個視野計數下室遷移和侵襲的細胞數目。每組設置3個復孔，重復實驗3次。

1.4 生物信息學分析

1.4.1 公共數據的獲取與處理 從TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數據庫中下載EC的轉錄組測序（RNA-seq）數據并獲得相應臨床患者的資料。EC轉錄組count數據經log2（x+1）轉化并提取LINC02038基因表達信息進行后續癌和癌旁組織的組間差異分析和生存分析。

1.4.2 功能富集分析 利用T C G A 數據探索LINC02038潛在的生物學功能和機制。以LINC02038表達中位數分組進行下游靶基因的差異分析，使用“clusterProfile” R包對篩選后的靶基因進行基因本體論（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），探索LINC02038在EC惡性進展中的潛在分子調控機制。

1.5 統計學方法

應用R 3.2統計軟件進行本研究所有數據的處理和分析。符合正態分布的計量指標，使用描述，腫瘤組織與癌旁組織比較使用比較采用配對t檢驗，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的指標比較使用Wilcoxon秩和檢驗；分類變量采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關分析。生存分析以Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存率的組間差異。Cox比例風險回歸模型分析LINC02038表達對EC預后的影響。所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 LINC02038在EC組織中高表達

相較于癌旁組織，LINC02038在EC癌組織中的表達水平上調（0.000 28±0.000 04vs0.000 15±0.000 02，P＜0.01；圖1A）。利用TCGA EC組織的測序數據分析亦得到了一致的結果（圖1B）。

圖1 LINC02038 在EC 組織的表達水平

2.2 LINC02038表達與EC臨床特征的相關性

進一步分析LINC02038表達與EC臨床病理特征之間的關系。LINC02038表達水平在不同年齡、病理類型、腫瘤分級和FIGO分期的EC患者間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 LINC02038 表達與EC 臨床病理特征的關系

2.3 LINC02038表達與EC預后的關系

利用TCGA數據分析LINC02038表達與EC預后的關系。結果顯示，高表達組和低表達組在不同時間點的生存曲線比較差異無統計學意義（P=0.396，圖3A）。單因素及多因素Cox回歸分析發現：與低表達組相比，高表達LINC02038的EC患者的死亡風險有一定下降，但差異不明顯（圖3B）。

圖3 LINC02038 表達與EC 預后的生存分析

2.4 LINC02038表達對EC細胞表型的影響

C C K-8 實驗顯示，與空白對照組相比，LINC02038過表達組的細胞增殖速率明顯升高（圖4 A）。兩組在第4 天時的增殖速率分別為：LINC02038過表達組1.26±0.10，對照組1.84±0.15，組間比較差異有統計學意義（P＜0.001）。Transwell遷移實驗發現，過表達LINC02038的EC細胞穿過小室的個數多于對照組（148.6±35.6vs80.9±32.4，P＜0.01）。但是在侵襲實驗中，兩組穿過小室的細胞數量比較差異無統計學意義（102.3±44.3vs76.8±36.4，P=0.201）。

圖4 LINC02038 的生物學效應

2.5 LINC02038在EC的潛在生物學功能分析

LINC02038高低表達組別的差異基因分析結果顯示，受LINC02038表達影響的差異基因有614個，其中包括228個表達上調基因，386個表達下調基因（圖5A）。利用上述差異基因進行富集分析，結果提示LINC02038可能參與細胞分化，細胞外基質重塑和激素分泌調控等生物學功能（圖5B），并影響藥物代謝、能量代謝及多條腫瘤相關信號通路（圖5C）。GSEA分析進一步提示，高表達LINC02038可激活Drug metabolism、ECMreceptor interaction、NF-κB等下游信號通路。

圖5 LINC02038 的功能富集分析

3 討 論

本研究探討了LINC02038與EC發生、發展之間的關聯。結果顯示LINC02038在EC癌組織中高表達，但其表達高低與患者預后無關。功能學實驗證實該lncRNA可影響EC腫瘤細胞的增殖和遷移，提示其在EC惡性進展中發揮著重要作用。

EC屬于婦女常見的生殖系統惡性腫瘤，近十余年來其發病率呈明顯上升趨勢，已經對婦女健康造成嚴重威脅［13］。大部分早期EC患者預后較好，5年生存率可達90%以上［14］。但仍有一部分患者存在癌灶轉移，導致預后不佳［15］。因此，深入闡明EC的發病起源和分子機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，對改善患者預后非常重要。眾多研究顯示，作為基因調控網絡中的新星分子，lncRNA為探究復雜疾病的發病機制提供了新的研究視角［5，16］。lncRNA能夠通過表觀遺傳、轉錄和轉錄后多種途徑調控基因的表達［9，17］，參與惡性腫瘤的發生、發展過程［8，18］。已有一些研究報道了特定的lncRNA在EC發生、發展過程中的關鍵調控作用。譬如，有研究報道lncRNA 淋巴細胞白血病缺失基因2（deleted in lymphocytic leukemia 2，DLEU2）在EC組織中高表達，其表達增加可導致EC預后不良。DLEU2通過與miR-455 競爭性結合誘導己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）表達或與果蠅zeste基因增強子人類同源物2相互作用解除miR-181a對HK2的沉默效應等不同機制，促進EC細胞糖酵解和上皮-間充質轉化轉移進程［19］。另有證據顯示lncRNA Opa相互作用蛋白5-反義轉錄物1在EC細胞系和組織中的表達異常下調，其通過與miR-200c-3p競爭性結合來控制EC細胞中的張力蛋白同源蛋白/蛋白激酶B通路來調節EC進展［20］。盡管已有大量證據證實了lncRNA在腫瘤進展過程中的重要功能，但是對于新發現的lncRNA在特定腫瘤中的表達規律和功能機制還需要深入研究，以進一步闡明其在癌癥發生、發展中的分子機制。

本次研究中，LINC02038在EC癌組織中高表達，但其表達水平與EC患者的總體生存率無關。這表明LINC02038可能是參與EC癌變過程的特異性分子，但其是否與預后相關仍需進一步研究。關于LINC02038與惡性腫瘤關系的報道不多。Liu等［12］發現LINC02038在結直腸癌中異常低表達，且與腫瘤轉移呈負相關。Zhao等［21］利用生物信息學分析發現LINC02038在乳腺癌中顯著高表達，是乳腺癌預后不良的重要生物標志。這些報道提示LINC02038在不同腫瘤類型中具有表達特異性，可能在腫瘤進展中發揮不同的生物學功能。為了進一步探究LINC02038在EC中的作用機制，我們構建了過表達LINC02038的EC細胞系，并檢測了其對細胞增殖和遷移侵襲能力的影響。結果發現高表達LINC02038能夠促進EC細胞的增殖和遷移。功能富集分析結果提示LINC02038參與細胞分化、激素分泌、細胞外基質重塑等生物學過程，并激活下游細胞外基質受體互作通路、NF-κB信號通路等。已有大量證據證實NF-κB信號通路的異常激活能促進EC發生和發展［22-23］。由此推測，高表達的LINC02038可能通過調控NF-κB信號通路，促進EC細胞增殖、遷移，從而促進EC癌變進程。然而，LINC02038如何激活NF-κB信號通路，以及其調控相關基因的表達機制，后續工作中仍需進一步探索。

綜上所述，LINC02038在EC中表達上調并具有促進腫瘤細胞增殖和遷移效應，可能成為EC發生過程中的重要調節因子，是EC診斷和治療的潛在靶點。今后還需開展進一步研究，深入闡明其分子調控機制。