矢車菊素半合成方法實驗教學實踐*

侯婷婷，劉渝鈳，楊勝男，孫萌萌，胡海鵬，王廣途，王晗光，吳賀君，蒲 祥

(四川農業大學 理學院，四川 雅安 625014)

有機化學實驗是農業院校面向化學、藥學、生科、食品等眾多專業開設的基礎課。現有有機化學實驗教材內容側重于培養學生掌握基礎實驗原理與基本操作技能，合成物質包括天然化合物、藥用有機化合物以及有機基礎原料，如香豆素[1]、阿司匹林[2]和乙酸乙酯[3]等物質的制備。然而，藥用或食用的天然活性成分的綜合性制備實驗項目仍偏少，且實驗內容設計與科研和生產實踐之間缺乏有效聯系。這不利于化學、藥學、生科、食品等相關專業學生在有機化學基礎實驗課程學習過程中培養從事有機化學研究或生產的從業興趣[4]。黃酮化合物是一類重要的天然化合物，隨化學化工行業發展人們對其研究也逐步深入，其中的花青素作為抗氧化的熱門分子，其相關合成實驗在有機化學實驗教學中仍較少。因此，有必要有計劃地將花青素的合成實驗融入有機化學實驗教學過程。

1 實驗背景

花青素是一種普遍存在于植物液泡中的水溶性色素，廣泛分布在植物的花朵、葉片和果實之中。它具有A-C-B典型三環結構，且B環上的羥基與生物活性密切相關，以致于其具有抗氧化、延緩衰老、抗癌、抗心血管疾病等作用[5]。2016年，Sui等[6]人發現，花青素的顏色會隨著熱處理從紅色漸變至橙色。由于具有顏色變化效應、無毒無害且有益于人體健康等眾多優點，使得花青素可作為食用色素[7-8]。

花青素具有抗氧化活性。抗氧化性是多酚類化合物的共同特點，即向活性自由基提供一個氫原子，而自身由于結構的高度離域，可使生成的自由基比之前的結構更為穩定。Plaza等[9]人對類黃酮化合物抗氧化能力研究的實驗中發現，取代基跟抗氧化性能密切相關。A環上5位和8位、7位和8位的成對羥基取代，均能對抗氧化能力做出有益貢獻；5位和7位的同時取代，對活性沒有影響；7位單獨取代沒有貢獻；6位單獨羥基取代反而會降低抗氧化活性；但5位的單獨取代可提高活性。B環上鄰位多羥基結構比羥基單取代結構抗氧化活性更強；C環上3位羥基為抗氧化活性必需基團。花青素的C環結構高度離域，且pH變化時具有形成共振結構能力，所以能生成穩定的自由基，展現高抗氧化活性，與槲皮素具有活性相當的抗氧化能力[9]。

在現代工業生產上，花青素大多是從藍莓、黑枸杞、葡萄和玉米等中提取，并通過分離純化制備。天然花青素的應用前景廣泛，但價格昂貴，因此尋找一種低成本、合成簡便的方法極具實用價值。矢車菊素是花青素中含量相對豐富的一種，其結構上有多個羥基。羥基保護常見的方法是甲基化保護法，采用的甲基化試劑通常為硫酸二甲酯和碘甲烷[10]，但二者均為致癌物質。2006年Kondo等[11]人采用TBSCl作為羥基保護試劑，描述了酚類TBS基團在酸性條件下相對穩定，類黃酮等多酚類物質的TBS保護基在酸性條件下很容易脫保護。TBSCl使用安全，但活性較低，通過加入催化劑DMAP可改變這一不足，還可以得到與甲基化保護法相當的產率，并且免去了脫除保護基步驟。該法酸化的同時可脫保護，與其它方法相比可減少損失，因此本實驗選用TBS保護羥基的方法。

2 實驗目的

掌握矢車菊素的三步合成法，通過形成硅醚以進行羥基保護，隨后將4位羰基還原為亞甲基，再加入三氟乙酸形成佯鹽并脫除保護基；掌握有機相洗滌、氫化鋁鋰后處理以及萃取純化等后處理方法；熟悉顏色變化現象與矢車菊素結構的聯系，利用顏色變化來監測反應進程；學會利用液相色譜質譜聯用和根據紫外特征對矢車菊素進行定性鑒別。

3 實驗原理

該實驗以槲皮素為原料，依次通過三步反應制備矢車菊素：采用TBS保護方法對羥基進行保護，利用四氫鋁鋰對4位羰基進行還原，在甲醇溶劑和三氟乙酸中進行成鹽并脫除TBS保護基。合成路線如圖1所示。

圖1 矢車菊素合成路線

羥基保護方法有成酯、成醚(烷基醚、硅醚)。成酯法后續脫除保護基需要在堿性條件下水解，而產物在堿性條件下有開環分解的風險，故不適用。成烷基醚，若在芐位，脫除可采用氫解，鄰二羥基結構可采用形成縮酮的方法進行成醚保護。甲基醚常用試劑為硫酸二甲酯和碘甲烷[12]，前者為危化試劑，致癌致畸，后者易揮發，具有肝臟毒性，不適用于本科實驗。綜合考慮本實驗底物結構及后續實驗操作，選擇采用TBSCl進行羥基保護。

針對羰基還原為亞甲基，有利用鋅汞齊和鹽酸酸性條件下的克萊門森還原、氫氧化鉀和肼的堿性條件下進行的黃鳴龍還原、利用二硫醇形成硫縮酮然后進行氫解的中性條件下的還原。相較于這些條件，直接利用氫化鋁鋰進行還原不失為一種直接簡便的方法。氫化鋁鋰是一種強的金屬化合物還原試劑，利用負氫離子進攻羰基碳，鋁離子絡合氧，進而拔除氧原子，通過控制LiAlH4用量，可將底物還原成亞甲基[12]。機理如圖2所示。

圖2 LiAlH4還原羰基的機理

4 試劑與儀器

槲皮素、叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、四氫呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、咪唑購自上海阿拉丁。AR級無水碳酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、氫氧化鈉、乙酸乙酯、石油醚、正己烷購自成都科隆化學。三氟乙酸(TFA)、氫化鋁鋰(LAH)購自河南北方偉業計量。薄層色譜硅膠板GF254購自青島海洋化工。

DF-101FS集熱式恒溫磁力攪拌器和SHZ-D(III)循環水真空泵(鞏義市予華儀器)、F80A制冰機(斯科茨曼制冰系統有限公司)、FA2004C電子天平(上海佑科)、DHG-9101恒溫干燥箱(上海三發)、ZF-1三用紫外分析儀(江蘇海門其林貝爾)、RE-2000A旋轉蒸發儀(愛來寶生物)、8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津)、Agilent Infinity Lab液質聯用儀(美國安捷倫)。

5 實驗操作步驟

5.1 羥基保護反應

稱取槲皮素 (5 mmol)1.6914 g、 咪唑 (70 mmol)4.767 g，TBSCl(70 mmol)10.55 g，加入5%～10%當量的DMAP，用 100 mL DMF溶解，于室溫(25 ℃)下攪拌4～5 h。將反應液轉移到 250 mL 分液漏斗中，加入 40 mL 的正己烷，震蕩搖勻后，加入 40 mL 的水搖勻洗滌，靜置分液，去除水相，再次加入 40 mL 水重復洗滌3次以除去DMF。加入 40 mL 飽和Na2CO3水溶液，洗滌3次除去DMAP。加入 40 mL 飽和NaCl溶液洗滌有機相3次。轉移有機相至燒杯，向其中加入適量無水硫酸鎂，攪拌后抽濾搜集濾液，減壓濃縮得到產物1(棕黃色)。

5.2 羰基還原反應

向裝有產物1的圓底燒瓶中投入攪拌子，加入 8 mL THF和 2 mL 的 1 mol/100 mL LiAlH4四氫呋喃溶液，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，25 ℃ 下反應 30 min(呈紅棕色)。冰浴條件下，進行反應的淬滅，向圓底燒瓶中加入 20 mL THF稀釋，再加入 0.76 mL(與LAH質量相等)水、0.76 mL 15%氫氧化鈉溶液，再加入 2.28 mL(三倍LAH的質量)的水，然后升溫至 25 ℃，并且恒溫攪拌 15 min。再加入無水硫酸鎂，直至加入的無水硫酸鎂不再結塊，攪拌 15 min。抽濾，取濾液進行減壓蒸發除去溶劑，得到產物2(紅棕色)。

5.3 成鹽與脫保護反應

向裝有產物2的圓底燒瓶中加入正己烷 40 mL，全部溶解，加入 20 mL 甲醇(結合TBS基團從而脫除保護)、TFA(25 mmol)2.595 mL 室溫下攪拌過夜，脫除保護基。通過觀察上層正己烷的顏色判斷反應進行的程度，當上層由紅色變為黃色即可。取甲醇層，減壓蒸發除溶劑，得產品(磚紅色)。實驗流程與典型實驗現象如圖3所示。

圖3 實驗流程與典型實驗現象圖

6 結果與討論

6.1 保護反應試劑用量及反應時間的確定

6.1.1 羥基保護反應時間、溫度及用量的確定

通過單因素實驗，篩選反應時間(0.5～6 h)，每半小時檢測1次。通過TLC發現，在4、5、6 h 時，各物質點無明顯差別，確定羥基保護反應時間為 4 h。反應溫度優化實驗(15～45 ℃)表明，溫度過高不利于反應進行，因為TBSCl對羥基進行保護后產生的HCl迅速被DMAP、咪唑兩種堿所中和，體系放出大量的熱。溫度過低也不利于反應進行，因為達不到反應進行所需的活化能。溫度為 25 ℃ 與 35 ℃ 時，TLC比較無明顯差異，因此最終確定的反應最佳溫度為 25 ℃。通過TLC監測不同量的TBSCl(5～15 eq)進行羥基保護反應時間為 4 h 時的雜質點狀況，得出最佳TBSCl用量為14當量，即 10.5504 g。TBSCl易吸潮水解為TBSOH，溶劑及空氣中的水分均易使其變質。

6.1.2 脫除保護基反應試劑用量及選擇

脫除TBS保護基機理如圖4所示。

圖4 脫除TBS保護基機理

在酸作用下，TBSOR1 (中間產物2)由硅醚轉變為TBSOR (叔丁基二甲基硅酯)，再在甲醇作用下形成硅甲醚并產生酸。 加入酸時體系立即變為紫紅色，而后攪拌脫保護過程中顏色無明顯變化。 得出反應是先進行酸化形成佯鹽，再進行脫保護，TBS對顏色無明顯影響，即對吸光度影響小。 TFA用量設置為底物槲皮素量的1當量、 5當量、 10當量、 20當量，即TFA用量為 0.143 mL、0.72 mL、1.43 mL、2.85 mL。當使用TFA量為 0.143 mL 時，攪拌 12 h 后靜置，得到分界模糊且上層正己烷仍為紅色體系。而使用 0.72 mL、1.43 mL、2.85 mL 的TFA時，分別在 9 h、8 h、8 h 得到分界明顯且上層正己烷為亮黃色，下層為紫紅色體系。因此確定最佳TFA用量為 1.43 mL。三氟甲磺酸、三氟乙酸、乙酸三者酸性由大到小，通過觀察體系由均相變為上層為亮黃色，下層為紫紅色的時間。發現三氟甲磺酸具有最強的脫保護能力，所需時間約為 5 h。而乙酸在 12 h 以后仍無明顯分層現象。確定最佳的脫保護試劑為三氟甲磺酸。

6.2 結構分析和表征

6.2.1 中間產物1的FT-IR

圖5 底物槲皮素(A)和產物1(B)的紅外譜圖

6.2.2 產物3的LC-MS及UV

首先對制備得到的終產物進行LC-MS分析，發現目標產物在正離子模式下相對分子質量為288，與矢車菊素相對分子質量一致(圖6A)。同時進行終產物紫外吸收光譜分析，測得最大吸收波長為 520 nm(圖6B)，由此表明成功制備矢車菊素。

圖6 目標產物EIC圖(m/z 288)與紫外吸收圖

6.2.3 矢車菊素穩定性實驗

在矢車菊素純化過程中，發現其不穩定，因此進行了pH(1～11)和溫度(-20～65 ℃)穩定性測試。結果表明(圖7)，隨pH增加，吸光度降低明顯，即pH增大降解速度加快，且隨時間延長，矢車菊素降解程度變大，顏色明顯從紅色變為棕黃色。時間為 0 h 時，顏色均為紅色，經較長時間放置后，僅pH為1的溶液呈紅色，pH為3呈粉紅色，pH為5和7的呈棕黃色，pH為9和11的呈無色，說明其在pH為1時最為穩定。不同溫度條件下矢車菊素穩定性實驗表明，隨測試溫度逐漸升高，產物降解程度隨時間延長逐漸提高，說明矢車菊素對溫度敏感，通過單因素實驗篩選得出最佳的儲存溫度為 -20 ℃。

圖7 目標產物穩定性實驗

7 結語

本文探究了矢車菊素的一種半合成方法，以槲皮素為底物，TBSCl進行羥基保護，LiAlH4進行4位羰基還原，最后用TFA脫保護并形成佯鹽，同時探索了關鍵反應試劑的用量、反應時間以及合適的后處理途徑。實驗共耗時14～15 h，矢車菊素終產率可達51.74%。本實驗所選用的試劑與原料價格比較便宜、毒性低且易于購買。實驗操作包括萃取、分液及濃縮等有機化學實驗基本操作，同時涉及磁力攪拌器、旋轉蒸發儀、紫外和紅外吸收光譜儀等常用儀器的使用，即可鞏固學生對黃酮類成分理化性質的認知，又可掌握食用色素矢車菊素的合成方法。實驗過程顏色變化現象明顯，易于通過肉眼觀察判斷反應進程，可有效激發學生的實驗興趣。因此本實驗適于開設為高等農業院校的有機化學綜合性實驗。