雷公藤內酯醇乏氧激活前藥的合成與結構表征*

張冬梅，闕慧卿，李 唯

(福建省醫(yī)學科學研究院 福建省醫(yī)學測試重點實驗室，福建 福州 350001)

有充足氧氣供給的腫瘤細胞會快速異常增殖，然而，快速異常增殖所需要的高耗氧量又會導致氧氣供應不足。氧氣供應不足導致腫瘤缺氧環(huán)境的形成[1]。缺氧可以通過激活腫瘤細胞內相關基因和蛋白改變，促進腫瘤的發(fā)展，使腫瘤產生耐藥性方面[2-3]。因此缺氧作為腫瘤的主要特征，是藥物研發(fā)所面臨的問題[4-6]。

雷公藤內酯醇在1972年從雷公藤中提取出來，是一個結構獨特的二萜類化合物[7]。雷公藤內酯醇具有廣泛的很強的抗腫瘤、抗炎、抗免疫活性。雷公藤內酯醇除了顯示出很強的抗腫瘤活性外，還顯示出廣譜的抗腫瘤活性，在體內外對多種腫瘤有效[8-10]。就多因素引起的腫瘤耐藥性來說，雷公藤內酯醇可以作用于多個信號通路，具有抗腫瘤耐藥性的特點[11]。然而，雷公藤內酯醇的選擇性差、毒性大，導致在臨床上的應用受到限制。為了達到降低雷公藤內酯醇毒性的目的，將前藥策略應用在雷公藤內酯醇上應該是一個有效的解決方法[12-16]。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

實驗儀器包括：電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司，型號：DHG-9070A)、分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：LE104E/02)、定時恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠有限公司，型號：90-2)、薄膜旋轉蒸發(fā)器(上海，型號：B-220)、循環(huán)冷卻器(上海-恒科學儀器有限公司，型號：BWR-03A)、核磁共振儀(德國布魯克、型號：Ascend 400)、循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司，型號：SHZ-D )、EYEAL高溫反應槽(JAPAN，型號：PS-1000)。

實驗試劑包括：雷公藤內酯醇(福建省醫(yī)學科學研究院)、阿霉素(羅恩試劑，97%)、吉它西濱(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)、2-硝基咪唑(羅恩試劑，97%)、3-溴丙酸乙酯(羅恩試劑，98%)、碘化鉀(羅恩試劑，AR)、碳酸鉀(羅恩試劑，AR)、N，N-二甲基甲酰胺(上海麥克林生化科技股份有限公司，AR)、甲醇(羅恩試劑，AR)、氫氧化鋰(羅恩試劑，98%)、二氯甲烷(羅恩試劑，AR)、乙酸乙酯(羅恩試劑，AR)、N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)、4-二甲氨基吡啶(羅恩試劑，99%)。

1.2 化合物1、Dox1和Gem1的合成

化合物1、Dox1和Gem1的合成路線如圖1所示。

圖1 化合物1、Dox1和Gem1的合成路線圖

1.3 實驗操作

1.3.1 3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯(1-1)的合成

將2-硝基咪唑 (0.018 moL，2 g)、 3-溴丙酸乙酯 (0.027 moL，3.46 mL)、 碘化鉀 (0.009 moL，1.49 g) 和適量碳酸鉀裝入 25 mL 圓底燒瓶中，加入干燥N，N-二甲基甲酰胺8 mL，加熱 100 ℃，攪拌 2 h。反應結束，后處理，濕法過柱 [V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=100∶5]，得3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯，收率為54%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.65(1H，d，J=0.96)，7.16(1H，d，J=0.96)，4.63(2H，t，J=7.2)，3.6(3H，s)，2.95(2H，t，J=7.2)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C8H11NaN4O3，236.0750；Found，236.0750。

1.3.2 3- (2-硝基-1H-咪唑-1-基) 丙酸 (1-2)的合成

將3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯溶解于甲醇-水[V(甲醇)∶V(水)=5∶1]溶液中，緩慢加入氫氧化鋰2.59 mL，將反應混合物室溫攪拌過夜。真空除去有機溶劑，用濃鹽酸調pH值至偏酸性，得3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸白色沉淀。過濾，烘干得白色固體，收率為80%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.65(1H，d，J=0.96)，7.16(1H，d，J=0.96)，4.58(2H，t，J=6.9)，2.85(2H，t，J=6.9)；HRMS (ESI)calcd for[M+Na]+：C6H7NaN4O3，208.0437；Found，208.0436。

1.3.3 目標產物(1)的合成

取雷公藤甲素(0.1 mmoL，50 mg)溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺2 mL中，攪拌條件下加入N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺(0.1 mmoL，20.6 mg)和催化量4-二甲氨基吡啶，攪拌30 min。將3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺2 mL中，加入到溶有雷公藤甲素的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，繼續(xù)攪拌過夜。反應結束，后處理，濕法過柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶2]，得到目標產物，收率為60%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.60(1H，d，J=7.56)，7.14(1H，d，J=7.56)，4.91-4.78(2H，m)，4.31-4.30(1H，m)，4.21(2H，t，J=6.48)，3.87(1H，d，J=5.16)，3.40(1H，d，J=6)，2.97(1H，d，J=1.32)，2.73(2H，t，J=6.48)，2.69-2.67(1H，m)，2.34(1H，q，J=6.84)，2.20-2.13(2H，m)，2.00-1.96(m，1H)，1.89-1.84(1H，m)，1.41-1.38(1H，m)，1.28-1.23(1H，m)，0.96(3H，s)，0.91(3H，d，J=6.84)，0.79(3H，d，J=6.84)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C26H29NaN9O3，550.1904；Found，550.1907。

1.3.4 Gem1的合成

方法同目標產物(1)的合成方法，吉西他濱、3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸、N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺和催化量4-二甲氨基吡啶，獲得最終產物，收率為60%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：11.10(1H，s)，8.27(1H，d，J=7.56)，7.61(1H，s)，7.21(1H，d，J=7.56)，7.16(1H，s)，6.33(1H，d，J=5.94)，6.17(1H，t，J=7.02)，5.31(1H，s)，4.67(2H，t，J=6.48)，4.20-4.18(1H，m)，3.91-3.89(1H，m)，3.81(1H，d，J=12.36)，3.66(1H，d，J=12.36)，3.04(2H，t，J=6.48)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C15H16NaF2N6O7，453.1049；Found，453.1050。

1.3.5 Dox1的合成

方法同目標產物(1)的合成方法，多柔比星、3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸、N，N’-二環(huán)乙基碳二亞胺和催化量4-二甲氨基吡啶，獲得最終產物，收率為45%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：14.02(1H，s)，13.24(1H，s)，9.30(1H，s)，7.77-7.75(1H，m)，7.67-7.66(1H，m)，7.42(1H，d，J=7.56)，7.39-7.38(1H，m)，7.26(1H，d，J=7.56)，5.47(1H，s)，5.37(1H，s)，4.91(1H，s)，4.80(1H，s)，4.69(2H，s)，4.07-4.05(1H，m)，4.01(2H，t，J=6.48)，3.9(3H，s)，3.55-3.51(1H，m)，3.38-3.36(1H，m)，3.26-3.23(1H，m)，3.14-3.11 (1H，m)，2.66(2H，t，J=6.48)，2.27-2.24(1H，m)，2.01-1.98 (1H，m)，1.93-1.90 (1H，m)，1.69-1.64 (1H，m)，1.56-1.53(1H，m)，1.07(3H，s)；HRMS (ESI)calcd for[M+Na]+：C33H34NaN14O4，733.2072；Found，733.2073。

2 結果

雷公藤內酯醇是一個具有獨特結構特征的三環(huán)二萜類化合物。確證結構中存在著三個關鍵官能團(一個α，β-不飽和內酯酮，三個環(huán)氧環(huán)，三個甲基)，再加上確證結構中其他氫信號在氫譜中的大致分布和氫的個數與標準的雷公藤內酯醇氫譜一致，就能確證此結構為雷公藤內酯醇。目標化合物是雷公藤內酯醇14-OH酯化產物。雷公藤內酯醇14-OH的信號消失，存在3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸酯的信號，再加上確證了雷公藤內酯醇的母核結構，就能確證目標化合物的結構。目標化合物的結構表征數據。 4.91至4.78存在多重裂縫的2個氫信號說明α，β-不飽和內酯酮中的活性亞甲基的存在，表明α，β-不飽和內酯酮的存在。4.31-4.30(1H，m)，3.87(1H，d，J=5.16)，3.40(1H，d，J=6)，2.97(1H，d，J=1.32)這幾個信號表明三個環(huán)氧環(huán)的存在。0.96(3H，s)，0.91(3H，d，J=6.84)，0.79(3H，d，J=6.84)說明三個甲基的存在。其余譜圖氫與標準譜圖氫的分布類似，而且氫的個數相等，說明雷公藤內酯醇的母核結構正確。加之7.60(1H，d，J=7.56)，7.14(1H，d，J=7.56)兩個硝基咪唑環(huán)上面的低場氫信號和兩對脂肪氫的信號，說明14-OH上連接著3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸酯。綜上確證了目標化合物的結構。

3 結論

本文合成了雷公藤內酯醇乏氧激活前藥，并對所合成的目標化合物進行了結構確證。首先以2-硝基咪唑和具有強刺激性氣味的3-溴丙酸乙酯為起始原料，通過親核取代和水解兩步反應，合成了3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸。起先用酸在常溫下水解酯鍵，但是當反應結束之后，用薄層層析板監(jiān)測反應，發(fā)現反應完全，有雜質產生。因此使用堿在常溫下水解酯鍵。縮合反應采用傳統(tǒng)的Steglich酯化反應，但是分析純的N，N-二甲基甲酰胺會很大程度的影響反應的進行。最后使用無水的N，N-二甲基甲酰胺，使得反應的收率提高。此外，還合成了兩個對照品Gem1和Dox1，為后續(xù)的抗腫瘤研究提供了有效的支持。