四溴聯(lián)苯醚通過溶酶體-內源性和外源性凋亡通路誘導褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)細胞凋亡

王釗寧,曹 賽,劉 倩,崔馨逸,周 斌,3,王 悠,3,周仲元*(.中國海洋大學海洋生命學院,山東 青島 66003；.青島市環(huán)境保護科學研究院,山東 青島 66003；3.嶗山實驗室,山東 青島 6607)

新污染物(ECs)是指尚未認定或尚未受法規(guī)規(guī)定,且對人類健康具有潛在危害的一大類新的污染物[1].我國就新污染物治理頒布文件《水污染防治行動計劃》、《新污染物治理行動方案》中指出要加強“近海海域生態(tài)保護”,建立健全環(huán)境風險評估和管控.新污染物多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類廣泛使用的溴代阻燃劑(BFRs),其以添加劑的形式與母體松散地混合,因此極易從產品中釋放,并通過水循環(huán)、大氣循環(huán)等途徑進入海洋環(huán)境中并廣泛存在于海洋環(huán)境與海洋生物體內[1-2].由于PBDEs 具有親脂性、生物蓄積性等特性,使其具有較強的慢性生物毒性,可對生物體的大腦、肝臟和腎臟等器官以及內分泌、神經、及生殖系統(tǒng)產生毒性作用[3-4].雖然很多國家擬定相關法案對PBDEs 的生產進行限制或直接禁止使用,由于PBDEs 化學性質的穩(wěn)定以及在生物體內的蓄積性,目前仍在許多地區(qū)的海水、沉積物中以及海洋生物體內檢測到不同水平PBDEs 的存在,并且PBDEs 水平保持著持續(xù)增長的趨勢[5-6].2013年我國渤海27 條河流入?？跈z測到PBDEs 最高值為38ng/L,2017年最高值達238ng/L,是2013年的6 倍之多[7].而在對珠江三角洲和南海沉積物中PBDEs 的含量高達7340ng/g[8],在巴西海域的10 種鯨類體內,肝臟中的PBDEs 濃度高達5960ng/g[9].

褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)是一種重要的海洋浮游動物,在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)和能量流動中起著重要作用.同時,褶皺臂尾輪蟲具有在海洋中分布廣泛、組織結構簡單、生命周期短、對環(huán)境變化敏感性高等優(yōu)勢,是實驗生態(tài)毒理學研究和環(huán)境基因組學研究中的模式生物[10].針對PBDEs對褶皺臂尾輪蟲毒性效應的前期研究,揭示了其毒性效應主要表現在對褶皺臂尾輪蟲的生長發(fā)育、攝食行為及生殖的損傷[11-12].本課題組前期研究初步發(fā)現PBDEs 中毒性較高的四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)能夠通過線粒體凋亡通路誘導褶皺臂尾輪蟲凋亡,證明ROS 所引起的氧化應激是造成BDE-47 對褶皺臂尾輪蟲毒性效應的主要原因;同時發(fā)現褶皺臂尾輪蟲在低濃度BDE-47 脅迫下的線粒體自噬現象,解釋了褶皺臂尾輪蟲在BDE-47 脅迫下生殖策略轉變,以及個體死亡的可能原因[13].

自噬被認為是生物為應對一定環(huán)境擾動下的“促生存策略”[14].溶酶體是參與細胞自噬過程中的關鍵細胞器,是決定細胞命運的重要“決策者”.在低于生物耐受閾值的環(huán)境擾動下,細胞可通過激活自噬在受損細胞中形成自噬小體將受損的細胞器、蛋白質運至溶酶體,在溶酶體酶的作用下消化、降解而重新利用[15],而研究表明,當溶酶體受損傷時,自噬活動受到抑制,最終觸發(fā)細胞凋亡[16].在前期研究中我們在低濃度BDE-47 脅迫下的輪蟲中發(fā)現自噬現象,表明輪蟲通過線粒體自噬作用清除受損的線粒體;而在高濃度BDE-47 脅迫下,褶皺臂尾輪蟲體內的受損線粒體無法通過自噬清除而激活凋亡[13],其原因是否與溶酶體損傷有關?由于溶酶體受損而導致凋亡的機制又是什么?據此本研究在課題組前期研究的基礎上運用轉錄組學技術進一步研究BDE-47 脅迫褶皺臂尾輪蟲的毒性效應,以溶酶體為切入點,更全面、精準地闡明褶皺臂尾輪蟲受BDE-47 脅迫的響應途徑和機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

受試生物褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)由休眠卵孵化.孵化條件:溫度為(25±1)℃,光照強度為1000～1200lx,光暗周期為12h:12h,餌料為小球藻(Chlorella sp.).孵出的輪蟲在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)馴化兩周,期間定時投喂小球藻,小球藻的密度控制在1×106m/L,輪蟲的密度控制在10ind/mL.餌料小球藻在三角燒瓶中培養(yǎng),接種時加入f/2 培養(yǎng)基并定時搖動燒瓶,防止小球藻貼壁和下沉.小球藻的培養(yǎng)條件除溫度((20±1)℃)外,其余條件同褶皺臂尾輪蟲.

四溴聯(lián)苯醚BDE-47(純度>99.99%,固體粉末)購自美國AccuStandard公司,二甲基亞砜DMSO(GC級)購自美國Sigma 公司,Cathepsin L 抑制劑(純度≥98.0%,固體粉末)購自MedChemExpress 公司.

海水取自青島即墨鰲山灣附近海域,使用前經0.45μm 濾膜過濾后高壓滅菌(121.3℃,0.105MPa,20min),滅菌后的海水鹽度為30‰,pH 值為8.6.

BDE-47 儲備液(2mg/L)配制:取5mg BDE-47,加入2.5mL DMSO 將其溶解,室溫避光保存,使用時用新鮮滅菌海水稀釋成所需濃度.

ROS 熒光探針DCFH-DA(S0033S)購自碧云天生物技術限公司.取1mmol/L 的DCFH-DA 探針用PBS 稀釋為10μmol/L 的工作液,-20℃保存.

吖啶橙(AO)熒光染色試劑盒(CA1142)購自北京索萊寶科技有限公司.

Cathepsin L 抑制劑儲備液(1mmol/L)配制:取1mg Cathepsin L 抑制劑,加入2.8mL 新鮮滅菌海水將其溶解,-20℃保存,使用時用新鮮滅菌海水稀釋成所需濃度.

1.2 轉錄組測序與分析(RNA-seq)

參與轉錄組測序的輪蟲共有2 組:空白對照組和BDE-47(0.08mg/L)處理組,每組3 個平行,每個平行約有10000 只輪蟲(約0.2g).脅迫期間不投喂小球藻.

脅迫24h 后收集輪蟲,用Trizol 試劑(Thermo Fisher Scientific 公司)提取輪蟲的總RNA.RNA 質檢合格后進行cDNA 文庫的制備,文庫通過Agilent 2100 生物分析儀進行質檢,質檢合格后,用Illumina HiSeq2000 高通量測序平臺對cDNA 文庫進行測序,得到大量的原始讀序(raw reads).對下機的raw reads利用fastp軟件進行質控,過濾低質量數據,得到clean reads.使用Trinity 軟件對clean reads 進行組裝,獲得Unigenes;通過blastx 軟件將Unigenes 序列比對到蛋白數據庫Nr、SwissProt、KEGG 和COG/KOG(e value<0.00001),獲得Unigenes 的蛋白功能注釋信息;使用Bowtie 和eXpress 軟件對Unigenes 表達水平進行定量;使用DESeq 軟件進行差異基因分析,設定P value<0.05,|log2(foldchange)|>1 的基因為差異基因(DEGs);對差異表達基因進行GO 和KEGG 富集分析,以判定差異基因主要影響的生物學功能或者通 路.

1.3 DEGs qRT-PCR 驗證

根據GO 和KEGG 富集分析結果,我們篩選了顯著性富集通路中關鍵的DEGs 進行qRT-PCR 驗證.應用Perl Primer 軟件設計引物(表1),以RNA-seq樣品的cDNA 為模板,以β-actin 為內參,采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(南京Vazyme 生物科技有限)實施qRT-PCR 反應.反應體系(10μL):cDNA 模板 1μL,正、反向引物各 0.2μL,ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5μL,Nuclease-free H2O 3.6μL.反應條件:95℃,30s;[95℃,10s;60℃,30s],重復40 個循環(huán);從60℃緩慢升溫至97℃,每1℃采集5次熒光信號.利用 Roche LC480Ⅱ熒光定量PCR 儀進行熒光定量檢測,數據采用2-ΔΔCt法進行分析.

表1 DEGs qRT-PCR 驗證的引物序列Table 1 Primer sequence verified by DEGs qRT-PCR

1.4 溶酶體膜損傷檢測

從培養(yǎng)的輪蟲中選取活潑健壯的成年褶皺臂尾輪蟲40 只,隨機分為空白對照組(滅菌海水)、溶劑對照組(0.04mL/L DMSO)、 BDE-47 處理組(0.08mg/L),每組10 只置于24 孔細胞培養(yǎng)板中.脅迫24h 后,加入5μg/L 的AO 染料,避光條件下震蕩混勻并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20min.將染色后的褶皺臂尾輪蟲放入PBS 中沖洗,置于載玻片上,用熒光顯微鏡(Olympus IX-71)對其進行觀察拍照,正常輪蟲均勻染成綠色熒光,溶酶體膜損傷輪蟲出現致密濃染的黃綠色顆?；蛲蛊?

1.5 ROS 熒光變化觀察

輪蟲的選取、收集、脅迫同1.4.脅迫24h 后,加入DCFH-DA染色工作液0.5mL,避光條件下震蕩混勻并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20min.將染色后的褶皺臂尾輪蟲放入PBS 中沖洗,置于載玻片上,用熒光顯微鏡(Olympus IX-71)對其進行觀察拍照.

1.6 凋亡通路上關鍵因子的測定

將褶皺臂尾輪蟲隨機分為空白對照組(滅菌海水)、溶劑對照組(0.04ml/L DMSO)、BDE-47 處理組(0.08mg/L BDE-47)和 Cathepsin L 抑制組(50μmol/L Cathepsin L 抑制劑+0.08mg/L BDE-47)4 組,每組3 個平行,每個平行約有10000 只輪蟲(約0.2g).脅迫24h 后,收集輪蟲,冰浴下超聲破碎(工作5s,間歇15s,工作8 次),破碎后的勻漿4℃,2500r/min,離心10min 取上清.測定上清的總蛋白含量(BCA 蛋白含量測定試劑盒,碧云天)、Cathepsin L 活性(Cathepsin L 酶聯(lián)免疫分析試劑盒,紀寧)、促凋亡因子Bax 含量(Bax 酶聯(lián)免疫分析試劑盒,紀寧)、抗凋亡因子Bcl-2 含量(Bax 酶聯(lián)免疫分析試劑盒,紀寧)、Caspase-3 活性(Caspase-3 活性檢測試劑盒,碧云天)、Caspase-8 活性(Caspase-8 活性檢測試劑盒,碧云天)和Caspase-9 活性(Caspase-9 活性檢測試劑盒,碧云天).

1.7 數據統(tǒng)計與分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0 對數據進行統(tǒng)計分析,數據以平均值±標準差(n=3)表示,通過單因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比較(LSD)進行組間差異的顯著性評估,P<0.05 的差異被認為是顯著的.

2 結果與分析

2.1 BDE-47 脅迫下褶皺臂尾輪蟲的差異基因分析

對褶皺臂尾輪蟲6 個樣本進行轉錄組測序后,共得到40.23Gb 的Clean Data,每個樣本的Clean Data 均達到6.38Gb,堿基百分比Q30 均大于93.4%,說明測序準確度高,可用于后續(xù)分析.以對照組褶皺臂尾輪蟲轉錄本為參考,對轉錄組數據進行比較,BDE-47 處理后共獲得 582 個差異表達基因(P<0.05,log2(FC)>1),其中上調表達基因84 個,下調表達基因498 個,基因的下調水平明顯高于上調水平(圖1).

圖1 差異表達基因的分析Fig.1 Analysis of differentially expressed genes

為了進一步研究響應BDE-47 脅迫的差異表達基因所參與的代謝途徑,對582 個差異表達基因結合基因數目、富集因子和q 值分析,進行了KEGG功能注釋和pathway 顯著性富集分析,結果表明(圖2、表2)差異基因顯著富集于核糖體(ko03010)、MAPK 信號通路(ko04010)、細胞凋亡(ko04210)、雌激素信號通路(ko04915)等途徑中,這些信號通路主要作用是參與調控細胞凋亡.其中,在核糖體中,共有60個差異性基因,且均顯著性下調.在MAPK信號通路中,共有10 個差異性基因,1 個上調基因,9 個下調基因.在細胞凋亡通路中,共11 個差異性基因,2 個上調基因,9 個下調基因.在雌激素信號通路中,共15個差異性基因,均為下調基因.

圖2 差異表達基因KEGG 通路富集分析Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

表2 顯著富集通路Table 2 Significantly enriched pathways

通過GO 富集對上述顯著性富集通路中的一些關鍵基因進行分析發(fā)現,關鍵基因核糖體基因rps3、rps9、hsp70、cam 呈顯著性下調;cacn、pod、ctsl和cyt c 呈顯著性上調(表3),且這些關鍵基因均與凋亡調控相關.對部分關鍵差異基因進行熒光定量PCR 驗證,結果表明BDE-47 抑制褶皺臂尾輪蟲鈣調蛋白CaM、熱激蛋白HSP 70 基因的表達,誘導類組織蛋白酶Cathepsin L 和過氧化物酶POD 基因的表達(圖3).qRT-PCR 與轉錄組測序結果在基因表達趨勢一致,說明轉錄組測序結果可靠.

圖3 差異表達基因的qRT-PCR 驗證Fig.3 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

表3 KEGG 通路中的關鍵差異表達基因Table 3 Key DEGs in KEGG pathways

2.2 BDE-47 脅迫造成褶皺臂尾輪蟲溶酶體損傷

為了研究溶酶體膜穩(wěn)定性,采用AO 染色法進行檢測.AO 染色結果顯示(圖4):對照組中的輪蟲呈均勻綠色熒光,與對照組相比,BDE-47 處理組褶皺臂尾輪蟲的出現橘紅色熒光顆粒,表明BDE-47 脅迫使得褶皺臂尾輪蟲細胞溶酶體膜受到了損傷,溶酶體膜穩(wěn)定性降低,通透性增強.

圖4 BDE-47 脅迫下褶皺臂尾輪蟲體內AO 熒光變化Fig.4 Changes in AO fluorescence in rotifers under BDE-47stress

圖5 BDE-47 脅迫下褶皺臂尾輪蟲體內Cathepsin L 含量Fig.5 Cathepsin L content of B.plicatilis under BDE-47 exposure

2.3 Cathepsin L 參與褶皺臂尾輪蟲凋亡

為明確Cathepsin L 在BDE-47 誘導輪蟲凋亡過程中的作用,使用50μmol/L Cathepsin L 抑制劑與 BDE-47 共同脅迫輪蟲,與空白對照組相比,BDE-47 單獨處理組中輪蟲體內的Cathepsin L 含量顯著上升(圖 5)(P<0.05),而在 50μmol/L Cathepsin L 抑制劑與 BDE-47 共同處理組中,Cathepsin L 含量顯著低于處理組(P<0.05),證明50μmol/L 的Cathepsin L 抑制劑能夠有效抑制Cathepsin L.

在確定Cathepsin L 抑制劑的有效濃度后,對輪蟲體內促凋亡因子Bax 和抗凋亡因子Bcl-2 含量測定,結果顯示,與空白對照組相比,BDE-47 處理組中輪蟲的Bax 含量顯著上升(P<0.05);與BDE-47 處理組相比,加入Cathepsin L 抑制劑后褶皺臂尾輪蟲體內的Bax 含量顯著降低(P<0.05)(圖6A).相反,與空白對照組相比,BDE-47 處理組中褶皺臂尾輪蟲體內的抗凋亡因子Bcl-2 含量顯著降低(P<0.05);加入Cathepsin L 抑制劑后褶皺臂尾輪蟲體內的Bcl-2 含量顯著上升(P<0.05)(圖6B).通過計算Bax/Bcl-2 的比值可以發(fā)現,與空白對照組相比,BDE-47 處理組中Bax/Bcl-2 的比值是顯著上升(P<0.05)(圖6C).在加入Cathepsin L 抑制后,Bax/Bcl-2 的比值顯著降低(P<0.05).

Caspase-3、-8、-9 含量的實驗結果如圖7所示:與空白對照組相比,BDE-47 處理組中輪蟲的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 含量均有顯著上升(P<0.05).在加入 Cathepsin L 抑制后,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 含量明顯降低(P<0.05).表明BDE-47 引起的Cathepsin L 釋放是導致褶皺臂尾輪蟲凋亡的主要原因.

2.4 BDE-47 脅迫對褶皺臂尾輪蟲ROS 水平的影響

經DCFH-DA 染色后,于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現,在對照組中(圖8A,B),褶皺臂尾輪蟲體內熒光較弱,說明ROS含量處于較低水平;而在0.08mg/L處理組中(圖 8C,D),可觀察到明顯的綠色熒光.說明BDE-47 脅迫能夠導致輪蟲體內ROS 含量的升高.

圖8 BDE-47 脅迫下褶皺臂尾輪蟲體內ROS 熒光變化Fig.8 Changes in ROS fluorescence in rotifers under BDE-47stress

3 討論

由大氣沉降、江河徑流等途徑進入海洋環(huán)境中的PBDEs 可被浮游食物網中的浮游植物、浮游動物、草食性或肉食性動物等所直接利用.過去關于PBDEs 對褶皺臂尾輪蟲的毒性效應的研究主要集中于種群數量、個體表型及行為等方面,但關于毒性效應的機制研究仍然不夠深入和全面.本研究在前期研究的基礎上繼續(xù)以模式生物褶皺臂尾輪蟲為研究對象,利用轉錄組技術分析BDE-47 脅迫24h 后體內的差異基因.研究發(fā)現在GO 富集上,輪蟲經脅迫后,在免疫系統(tǒng)、信號轉導、細胞器及抗氧化系統(tǒng)有關條目中存在大量差異基因的富集.這些差異基因在核糖體、細胞凋亡、MAPK 和雌激素信號等KEGG 代謝通路上顯著富集.在核糖體相關功能基因中,核糖體蛋白(RP)基因顯著下調.RP 是位于核糖體小亞基上的蛋白質,在DNA 修復、細胞凋亡等細胞事件中起重要調控作用,RP 的缺乏會導致核糖體和蛋白質的合成減少.研究表明缺少rps6 的小鼠在部分肝切除手術后,肝細胞無法正常增殖[17].在人類及高等哺乳類動物中的研究表明核糖體蛋白S3(RPS3)能夠在線粒體積累,修復DNA 損傷[18-19];rps9 表達被抑制后,骨髓瘤細胞凋亡加劇、細胞周期阻滯[20].在本研究中,轉錄組結果顯示RPS3、RPS9等核糖體蛋白顯著下調,說明輪蟲受到脅迫后細胞的生長、增殖、蛋白質翻譯發(fā)生異常.除核糖體代謝通路有明顯變化外,本研究發(fā)現在涉及雌激素代謝通路中的關鍵基因cam 在BDE-47 脅迫下表達顯著下降.雌激素是具有廣泛生物學活性的類固醇激素,具有促進細胞增殖、分化,抑制細胞凋亡的作用[21].MAPK 是在細胞內廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶.研究表明MAPK 能夠參與細胞增殖、免疫、凋亡等一系列生物進程中[22].Vilatoba 等[23]在研究中發(fā)現,雌激素能夠通過激活p38β 抑制p38α 改善缺血再灌注損傷后的細胞存活.此外,雌激素可以通過促進細胞內Ca2+轉運,增加細胞內Ca2+濃度和cam 的基因表達,激活Wnt/Ca2+信號通路,加快細胞增殖分化[24].本研究在顯著富集通路中發(fā)現cam基因的表達下降,表明BDE-47 脅迫抑制了輪蟲體內雌激素代謝通路;凋亡通路和誘導凋亡的經典MAPK 信號通路中的關鍵基因cyt c 和cacn 的表達量在BDE-47 脅迫時出現顯著上調,說明BDE-47 的脅迫能夠誘導輪蟲的凋亡.這可能與輪蟲在受到BDE-47 脅迫時促進細胞增殖分化的雌激素通路受抑制相關.

溶酶體是細胞內主要的消化中心,能有效降解蛋白質、脂肪等生物大分子物質,且細胞內未折疊或錯誤折疊的蛋白主要通過自噬途經被捕獲至溶酶體內進行降解[25-26].Cathepsin L 是存在于溶酶體內的凋亡介質,可以通過凋亡相關通路參與細胞凋亡.當溶酶體膜完整性受損時可以導致Cathepsin L 釋放,進而導致細胞凋亡[27-28].Du 等[29]的研究表明,使用Cathepsin L 抑制劑可減少大鼠大腦動脈缺血后的組Cathepsin L 表達,降低胞漿中細胞色素C 含量及 Caspase-3 活性,表明 Cathepsin L 可能位于Caspase 信號的上游,調控Caspase 介導的細胞凋亡.通過對凋亡通路相關差異基因的轉錄組學分析以及qPCR 熒光定量驗證,我們發(fā)現Cathepsin L 在BDE-47 脅迫后表達量呈顯著性上升.因此推測輪蟲體內的溶酶體可能是BDE-47 脅迫的靶器官,在BDE-47 脅迫下,輪蟲體內的溶酶體受到損傷,受損傷的溶酶體一方面釋放出大量的Cathepsin L,激活凋亡信號通路;另一方面,由于溶酶體損傷導致其功能受損,無法消化降解由核糖體產生的錯誤異常蛋白質,最終導致細胞凋亡.

通過AO 染色發(fā)現經BDE-47 脅迫的輪蟲體內溶酶體膜受到顯著損傷,通透性增強.qPCR 熒光定量發(fā)現抑制溶酶體膜通透性升高從而起到穩(wěn)定溶酶體膜作用的關鍵蛋白HSP70 和在啟動溶酶體修復機制中起關鍵作用的cam 基因表達顯著降低,進一步證明輪蟲體內的溶酶體在BDE-47 脅迫下結構嚴重破壞,且損傷無法修復逆轉,最后破裂釋放組Cathepsin L.為進一步驗證我們的推測,探究溶酶體損傷與輪蟲凋亡的關系,我們通過對內源性凋亡通路,即線粒體通路的Bcl-2 家族調控蛋白和Caspase級聯(lián)反應中的關鍵凋亡蛋白進行測定,結果發(fā)現BDE-47 脅迫會引起褶皺臂尾輪蟲的促凋亡因子Bax 表達量的升高以及抗凋亡因子Bcl-2 表達量的降低,導致Bax/Bcl-2 的比值上升,表明BDE-47 的脅迫誘導褶皺臂尾輪蟲凋亡,同時也說明內源性凋亡通路被激活;而在加入 Cathepsin L 抑制劑后,Cathepsin L 得到有效的抑制,同時凋亡因子Bax/Bcl-2 比率、Caspase-3、-9 蛋白表達受到顯著抑制,證明溶酶體受損傷引發(fā)的Cathepsin L 釋放,是誘導輪蟲凋亡通路響應的重要因素之一.此外,我們發(fā)現外源性凋亡通路,死亡受體通路中的關鍵蛋白Caspase-8 蛋白表達顯著升高.Caspase-8 在死亡受體通路中可在腫瘤壞死因子(TNF-α)與細胞膜表面的腫瘤壞死因子(TNFR)結合后引起受體互作蛋白激酶(RIPK)活化,誘導凋亡發(fā)生[30-31].在加入Cathepsin L抑制劑后,Caspase-8蛋白表達受到抑制,證明溶酶體損傷能夠同時引起內源性、外源性凋亡通路介導的凋亡.

活性氧(ROS)是細胞呼吸和細胞在外界因素脅迫下產生的由自由基和非自由基氧化的分子,參與到細胞增殖,凋亡,基因轉錄和表達的調節(jié).當ROS過量產生時能夠分別激活內源性和外源性凋亡通路誘導細胞凋亡[32-33].例如,在Hela 細胞中,過量的H2O2能夠使線粒體膜電位去極化,釋放Cyt C,引發(fā)caspase 聯(lián)級反應,通過線粒體通路誘導凋亡[34].在小鼠腸外上皮細胞中,過量的H2O2能夠上調位于細胞表面的死亡因子FasL 和其受體Fas 并通過FADD活化caspase-8,激活死亡受體通路誘導凋亡[35].溶酶體是鐵的主要儲存場所之一,溶酶體中游離的鐵離子可以通過芬頓反應產生ROS,當溶酶體膜破壞時,會導致大量ROS 釋放,是引發(fā)凋亡的另一種機制[36].過氧化物酶(POD)是抗氧化酶之一,在體內ROS含量過多時,能夠激活體內抗氧化系統(tǒng),使得POD 的升高.在本研究中發(fā)現在BDE-47 脅迫下,輪蟲體內的表征ROS 含量的熒光顯著增強,表明ROS 含量的顯著上升,同時輪蟲體內POD 蛋白表達升高,進一步證明輪蟲體內的ROS 的過量產生.據此,我們認為溶酶體受到損傷后釋放出ROS 是溶酶體受損引發(fā)輪蟲凋亡的另一種方式(圖9).

圖9 BDE-47 誘導褶皺臂尾輪蟲細胞凋亡機制Fig.9 The mechanism of BDE-47 inducing apoptosis in rotifers

4 結論

4.1 BDE-47 脅迫下,核糖體、雌激素通路、MAPK通路、凋亡通路等差異基因富集較顯著.

4.2 證明“溶酶體損傷-組織蛋白酶釋放-由經典凋亡途徑誘導細胞凋亡”這一過程,初步探究褶皺臂尾輪蟲Cathepsin L 的作用.本研究結果為進一步研究PBDEs 的毒性效應途徑和機制提供了新思路.

4.3 溶酶體受損釋放出大量的ROS 是誘導輪蟲發(fā)生凋亡的另一種方式.